Пищевая микробиология. Лабораторный практикум

Лабораторная работа № 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОНДИТЕРСКИХ ИЗДЕЛИЙ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Освоить методы микробиологического анализа кондитерских изделий.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; резиновые груши; весы электронные; ножи; металлические шпатели; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные: фарфоровая ступка диаметром 10 см; фарфоровый пестик; пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло.

Раствор карболового генцианвиолета; раствор Люголя; раствор водного фуксина; физиологический раствор для приготовления препарата в капельницах.

Вафли или печенье; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке вместимостью 100 мл; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С агаризованным солодовым суслом.

Пробирки с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора; флаконы с 90 мл стерильного пептонно-солевого раствора; пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объекти-

31

ва микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Упаковку с продуктом протереть тампоном, смоченным 70 %- ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

В непосредственной близости от пламени спиртовки стерильными инструментами (смоченными 70 %-ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки) вскрыть упаковку.

Отбор навески

Продукт в раскрытой упаковке тщательно измельчить стерильными (смоченными 70 %-ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки) ножницами, тщательно перемешать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) металлическим шпателем.

Продукт отобрать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) металлическим шпателем или пинцетом, перенести в предварительно взвешенную стерильную фарфоровую ступку и взвесить 10±0,1 г.

Приготовление разведений

1. Для получения первого десятикратного разведения к навеске продукта массой 10±0,1 г добавить 90 мл стерильного пептонносолевого раствора.

Смесь перемешать или гомогенизировать стерильным фарфоровым пестиком до получения однородной консистенции продукта.

Если при гомогенизации продукта получена неоднородная масса, то отстоять ее в течение 15 мин. и для посева и (или) приготовления разведений использовать надосадочную жидкость.

32

Таким образом получить разведение продукта в 10 раз (10-1 разведение), в 1 мл которого содержится 0,1 г продукта.

2.Для получения разведения продукта в 100 раз (10-2 разведение),

в1 мл которого содержится 0,01 г продукта, стерильной пипеткой взять 1 мл из 10-1 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

3.Для получения разведения продукта в 1000 раз (10-3 разведе-

ние), в 1 мл которого содержится 0,001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-2 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

Интервал между приготовлением навесок продукта, их разведениями и посевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.

При посеве в чашки Петри посевной материал вносить от большего разведения к меньшему. В этом случае можно пользоваться одной пипеткой.

Определение количества мезофильных аэробных и факультатив- но-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Первый этап

1.При исследовании вафель высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри: 1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) и 1 мл из 10-2 разведения (0,01 г) продукта.

При исследовании печенья высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри: 1 мл из 10-2 разведения (0,01 г) и 1 мл из 10-3 разведения (0,001 г) продукта.

2.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (45±1) °С питательным агаром.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (30±1) °С

втечение (72±3) ч.

33

Второй этап

1. Подсчитать количество колоний, выросших на чашках Петри. Для подсчета отобрать чашки Петри, на которых выросло от 15

до 300 колоний.

2.По результатам подсчета вычислить среднее арифметическое значение числа колоний из всех посевов одного разведения.

Если число колоний в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений соответствует требованиям, то вычислить среднее арифметическое количество микроорганизмов в каждом из этих отдельных разведений.

Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем

в2 pазa, то оценку провести по результатам посева наибольшего разведения.

Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний меньше 15 или больше 300, эти результаты использовать для подсчета среднеарифметического значения и при соответствии полученного значения интервалу от 15 до 300 использовать его для дальнейших расчетов.

3.Полученные среднеарифметические значения округлить:

до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;

до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

4. Количество микроорганизмов в 1,0 г (мл) продукта вычисляют по формуле

M Vn C ,

где n – степень разведения навески;

М – объем инокулята, внесенный на чашку Петри, мл; С – округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Результат вычисления выразить числом от 1,0 до 9,9 × 10n .

34

Результаты определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов записать следующим образом: «КМАФАнМ … (число от 1,0 до 9,9 × 10n) КОЕ/г».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения или число подтвержденных колонии меньше 15, результаты записать следующим образом: «КМАФАнМ < (15 · n/V) КОЕ/г».

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует, то результат выразить следующим образом: «КМАФАнМ < (1 · n/V) КОЕ/г».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300, то результат выразить следующим образом: «КМАФАнМ > (300 · n/V) КОЕ/г».

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП) Первый этап

1.1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта внести пипеткой в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч.

Второй этап

1.Посевы просмотреть через (24+3) ч., отметить положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет провести через

(48±3) ч.

Положительными считать посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды и образовании газа.

2.При необходимости для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к БГКП сделать пересевы на поверхность среды Эндо.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) °С

втечение (24±3) ч.

35

Третий этап

1.Просмотреть посевы и отметить рост характерных колоний: бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

2.При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к БГКП из чашек Петри с посевами отобрать не менее чем по 5 колоний. Из каждой отобранной колонии приготовить мазок и окрасить по Граму.

БГКП являются грамотрицательными палочками.

Результаты определения количества колиформных бактерий записать следующим образом:

«БГКП обнаружены в … (указывается исследуемая масса продукта в г)» или «БГКП в … (указывается исследуемая масса продукта в г) не обнаружены».

Определение дрожжей и плесневых грибов Первый этап

1.По 1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри.

2.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (45±1) °С агаризованным солодовым суслом. Параллельно с этим залить в чашку Петри 15-20 мл среды для проверки ее стерильности.

3.Посевы термостатировать при температуре (24+1) °С в течение

5 сут.

Второй этап

1. Через 5 сут. провести окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделить визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.

36

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо провести очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний.

2.Для количественного подсчета отобрать чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

3.При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов провести микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний приготовить препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло нанести каплю физиологического раствора. Затем в эту каплю прокаленной петлей внести часть колонии. Полученную суспензию покрыть покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценить, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в табл. 3.

Таблица 3

Характеристика дрожжей и плесневых грибов

Группа

Характеристика

микроорганизмов

Одноклеточные микроорганизмы, клетки овальной,

Дрожжи

круглой или продолговатой формы, длина клеток от 2,5 до 30 мкм и ширина от 2,5 до 10 мкм, клетки часто почкуются

Состоят из нитей – гифов, гифы не имеют перегородок

Плесневые грибы

или разделены на клетки. Гифы образуют боковые выросты и разветвления, от вегетативных гифов поднимаются гифы, несущие плодовые тела

4. Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дать заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

37

5.Результаты обработать и пересчитать отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

6.Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г продукта вычислить по формуле

где ΣC – сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях;

n1 – количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

n2 – количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

n – степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Результаты определения количества дрожжей и плесневых грибов записать следующим образом:

«плесневых грибов … (число от 1,0 до 9,9 × 10n) КОЕ/г»;

«дрожжей… (число от 1,0 до 9,9 × 10n) КОЕ/г».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения или число подтвержденных колоний меньше 5 (для плесневых грибов) или 15 (для дрожжей), результаты записать следующим образом:

«плесневых грибов < (5 · n/m) КОЕ/г», где n – степень разведения навески; V – объем инокулята, внесенный в чашку Петри, мл;

«дрожжей < (15 · n/V) КОЕ/г».

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует, то результат записать следующим образом:

«плесневых грибов < (1 · n/V) КОЕ/г»;

«дрожжей < (1 · n/V) КОЕ/г».

38

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 50 (для плесневых грибов) или 150 (для дрожжей), то результат записать следующим образом:

«плесневых грибов > (50 · n/V) КОЕ/г»;

«дрожжей > (150 · n/V) КОЕ/г».

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), бактерий группы кишечных палочек (БГКП), дрожжей и плесневых грибов в кондитерских изделиях.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы

Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы. Подробно описать методику проведения работы.

Вскрыть упаковку и сделать навеску печенья и вафель. Сделать ряд последовательных десятикратных разведений навески печенья и вафель. Выявить бактерии группы кишечных палочек (БГКП) в печенье и вафлях. Определить количество дрожжей и плесневых грибов в печенье и вафлях. Сделать вывод о качестве печенья и вафель и записать его в тетрадь.

Результаты работы

Окончательные результаты анализа (содержание КМАФАнМ, БГКП, дрожжей и плесеней) занести в тетрадь.

39

Сравнить полученные показатели с требованиями Санитарноэпидемиологических правил и нормативов (СанПиН) 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (табл. 4).

Сделать вывод о качестве пищевого продукта и записать его в тетрадь.

Таблица 4

Микробиологические показатели безопасности кондитерских изделий

(СанПиН 2.3.2.1078-01) [5]

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой продукта?

2.Как отобрать навеску исследуемого продукта?

3.Как приготовить исходное разведение исследуемого продукта?

4.Как провести посев разведения продукта в плотные питательные среды глубинным методом?

40