Пищевая микробиология. Лабораторный практикум

5.Как провести посев навески или разведения продукта в жидкие питательные среды?

6.Как определить количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов в пищевых продуктах?

7.Как выявить бактерии группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в пищевых продуктах?

8.Как определить наличие дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах?

Лабораторная работа № 5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МАРГАРИНА И МАЙОНЕЗА

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Освоить методы микробиологического анализа маргарина и майонеза.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; резиновая груша; весы электронные; нож; металлический шпатель; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные: фарфоровая ступка диаметром 10 см; фарфоровый пестик; пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри; стерильная стеклянная колба с притертой пробкой вместимостью 100 мл.

Маргарин, майонез. Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло. Раствор карболового генцианвиолета в капельнице; раствор Лю-

голя в капельнице; раствор водного фуксина в капельнице; физиологический раствор в капельнице для приготовления препарата.

41

70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке вместимостью 100 мл; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С агаризованным солодовым суслом.

Пробирки с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, флаконы с 90 мл стерильного пептонно-солевого раствора, пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Универсальная индикаторная бумага; спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Упаковку с продуктом очистить от загрязнений:

–герметично укупоренную стеклянную тару с майонезом помыть водой с детергентом, затем ополоснуть чистой водопроводной водой

ивысушить;

–негерметичную упаковку с маргарином протереть тампоном, смоченным 70 %-ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

Вскрытие упаковки провести в непосредственной близости от пламени спиртовки стерильными инструментами (смоченными 70 %- ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки).

Отбор навески Маргарин разрезать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом,

затем обожженным в пламени спиртовки) ножом на несколько частей. Навеску массой около 20±0,1 г отобрать стерильным (смоченным 70 %- ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) ножом или

42

скальпелем с поверхности срезов из разных мест, перенести в стерильную стеклянную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл и расплавить на водяной бане, нагретой до 40-45 °С.

Майонез тщательно перемешать стерильным (смоченным 70 %- ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) металлическим шпателем, перенести в предварительно взвешенную стерильную фарфоровую ступку и взвесить 10±0,1 г.

Приготовление разведений майонеза

1.Для получения первого десятикратного разведения к навеске продукта массой 10±0,1 г добавить 90 мл стерильного пептонносолевого раствора.

Смесь перемешать или гомогенизировать стерильным фарфоровым пестиком до получения однородной консистенции продукта.

Если при гомогенизации продукта получена неоднородная масса, то отстоять ее в течение 15 мин. и для посева и (или) приготовления

разведений использовать надосадочную жидкость.

Таким образом, получить разведение продукта в 10 раз (10-1 разведение), в 1 мл которого содержится 0,1 г продукта.

2.Провести нейтрализацию первого десятикратного разведения майонеза стерильным 10 %-ным раствором карбоната натрия при помощи пипетки до рН = 7. Значение рН определить с помощью универсальной индикаторной бумаги.

3.Для получения разведения майонеза в 100 раз (10-2 разведение),

в1 мл которого содержится 0,01 г продукта, стерильной пипеткой взять 1 мл из 10-1 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

Интервал между приготовлением навесок продукта, их разведениями и посевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.

При посеве в чашки Петри посевной материал вносить от большего разведения к меньшему. В этом случае пользоваться одной пипеткой.

43

Приготовление разведений маргарина

1.Из расплавленного маргарина после перемешивания стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл и внести в пробирку с 9 мл пептон- но-солевого раствора, подогретого до 40-45 °С, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Таким образом получить разведение продукта

в10 раз (10-1 разведение), в 1 мл которого содержится 0,1 г продукта.

3.Для получения разведения маргарина в 100 раз (10-2 разведе-

ние), в 1 мл которого содержится 0,01 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-1 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, подогретого до 40-45 °С, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной нагретой пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

3.Для получения разведения маргарина в 1000 раз (10-3 разведе-

ние), в 1 мл которого содержится 0,001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-2 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора, подогретого до 40-45 °С, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной нагретой пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

Интервал между приготовлением навесок продукта, их разведениями и посевом в питательные среды не должен превышать 30 мин.

При посеве в чашки Петри посевной материал вносить от большего разведения к меньшему. В этом случае пользоваться одной пипеткой.

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП) Первый этап

1.1 мл из 10-2 разведения майонеза (0,01 г) или 1 мл из 10-3 разведения маргарина (0,001 г) пипеткой внести в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) °С

втечение 24-48 ч.

44

Второй этап

1.Посевы просмотреть через (24+3) ч., отметить положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет проводить через

(48±3) ч.

Положительными считать посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды и образовании газа.

2.При необходимости для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к БГКП сделать пересевы на поверхность среды Эндо с таким расчетом, чтобы получить отдельные колонии, для чего взять петлей минимальное количество посевного материала и произвести посев частым штрихом.

Перед посевом дно чашки со средой Эндо разделить на четыре сектора. Посев из каждой пробирки со средой Кесслер произвести на отдельный сектор.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) °С

втечение (24±3) ч.

Третий этап

1.Просмотреть посевы и отметить рост характерных колоний: бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

2.При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к БГКП из чашек Петри с посевами отобрать не менее чем по 5 колоний. Из каждой отобранной колонии приготовить мазок и окрасить по Граму.

БГКП являются грамотрицательными палочками.

Результаты определения количества колиформных бактерий записать следующим образом:

«БГКП обнаружены в … (указывается исследуемая масса продукта в г)» или «БГКП в … (указывается исследуемая масса продукта в г) не обнаружены».

45

Определение дрожжей и плесневых грибов Первый этап

1.1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) и 1 мл из 10-2 (0,01 г) разведения маргарина или майонеза высеять параллельно в две чашки Петри.

2.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (50±1) °С агаризованным солодовым суслом. Параллельно с этим залить в чашку Петри 15-20 мл среды для проверки ее стерильности.

3.Посевы термостатировать при температуре 24+1 °С в течение 5 сут.

Второй этап

1.Через 5 сут. провести окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделить визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов проводить очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний.

2.Для количественного подсчета отобрать чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

3.При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов провести микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний приготовить препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло нанести каплю физиологического раствора. Затем в эту каплю прокаленной петлей внести часть колонии. Полученную суспензию покрыть покровным стеклом.

46

Результаты микроскопирования оценить, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в табл. 3.

4.Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дать заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

5.Результаты обработать и пересчитать отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

6.Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г продукта вычислить по формуле

где ΣC – сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях;

n1 – количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разведения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

n2 – количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения;

n – степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Результаты определения количества дрожжей и плесневых грибов записать следующим образом:

–«плесневых грибов … (число от 1,0 до 9,9 × 10n) КОЕ/г»;

–«дрожжей… (число от 1,0 до 9,9 × 10n) КОЕ/г».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения или число подтвержденных колоний меньше 5 (для плесневых грибов) или 15 (для дрожжей), результаты записать следующим образом:

–«плесневых грибов < (5 · n/V) КОЕ/г», где n – степень разведения навески; V – объем инокулята, внесенный в чашку Петри, см3;

–«дрожжей < (15 · n/V) КОЕ/г».

47

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует, то результат записать следующим образом:

–«плесневых грибов < (1 · n/V) КОЕ/г»;

–«дрожжей < (1 · n/V) КОЕ/г».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 50 (для плесневых грибов) или 150 (для дрожжей), то результат записать следующим образом:

–«плесневых грибов > (50 · n/V) КОЕ/г»;

–«дрожжей > (150 · n/V) КОЕ/г».

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), бактерий группы кишечных палочек (БГКП), дрожжей и плесневых грибов в маргарине и майонезе.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы

Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы. Подробно описать методику проведения работы.

Вскрыть упаковку и сделать навеску маргарина или майонеза. Сделать ряд последовательных десятикратных разведений навески маргарина или майонеза. Выявить бактерии группы кишечных палочек (БГКП) в маргарине или майонезе. Определить количество дрожжей и плесневых грибов в маргарине или майонезе. Сделать вывод о качестве маргарина или майонеза и записать его в отчет.

48

Результаты работы

Окончательные результаты анализа (БГКП, дрожжей и плесеней) занести в тетрадь.

Сравнить полученные показатели с требованиями нормативов, изложенных в «Инструкции по санитарно-бактериологическому контролю производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой промышленности» [6]:

–маргарин (отсутствие БГКП в 0,001 г; не более 5000 клеток дрожжей в 1 г; не более 100 клеток плесневых грибов в 1 г);

–майонез (отсутствие БГКП в 0,01 г; не более 5000 клеток дрожжей в 1 г; не более 100 клеток плесневых грибов в 1 г).

Сделать вывод о качестве пищевого продукта и записать его в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой майонеза?

2.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой маргарина?

3.Как отобрать навеску маргарина?

4.Как отобрать навеску майонеза?

5.Как провести ряд последовательных десятикратных разведений исследуемого продукта?

6.Как выявить бактерии группы кишечных палочек (колиформные бактерии) в маргарине и майонезе?

7.Как определить наличие дрожжей и плесневых грибов в маргарине и майонезе?

49

ЛИТЕРАТУРА

1.Лабораторный практикум по микробиологии / Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенко, Н.А. Горнова, Н.А. Гусарова. – М.: Дели принт, 2001. – 131 с.

2.Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учеб. пособ. / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. – М.: Медицина, 2004. – 576 с.

3.Практикум по микробиологии: учеб. пособ. для студентов высших учебных заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

4.Инструкция санитарно-микробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства: ИК 10-04-06-140-87. – М.: Госагропром СССР,

1988. – 55 с.

5.Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. – СанПиН

2.3.2.1078-01, М.: РИТ ЭКСПРЕСС, 2002. – 216 с.

6.Инструкция по санитарно-бактериологическому контролю производства маргарина и майонеза на предприятиях маргариновой промышленности. – Л.:

Госагропром СССР, 1989. – 32 с.

50