Пищевая микробиология. Лабораторный практикум

в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дать отрицательный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды.

При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполнить оксидазный тест.

Постановка оксидазного теста. Мембранный фильтр с выросши-

ми на нем колониями бактерий перенести пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивами для определения оксидазной активности бактерий. Через 2-4 мин. определить результат.

Все посиневшие колонии или колонии с синим ободком имеют активную оксидазу; колонии, не изменившие цвета, оксидазной активностью не обладают.

3.При наличии на фильтрах только оксидазоположительных колоний дать отрицательный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды.

Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском

ибез него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек.

4.При наличии на фильтратах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью подсчитать их и подтвердить принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2-3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду Гисса с глюкозой.

Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции перенести обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее чем через 5 мин.) пересеить оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду Гисса с глюкозой.

5.Посевы инкубировать в термостате при 37±0,5 °С в течение 4-5 ч.

11

Третий этап

1.При наличии кислоты и газа получить положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получить отрицательный результат.

2.При наличии только кислоты пробирки оставить на 24 ч. для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч. получить окончательный отрицательный результат, при наличии газа

–положительный результат.

Вычисление коли-индекса. Результат выразить в виде колииндекса, т.е. количества бактерий группы кишечных палочек в 1 мл воды.

Коли-индекс высчитать следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножить на 1000 мл и разделить на анализируемый объем воды.

При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек коли-индекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.

Пример 1. При посеве 300 мл воды не выросло ни одной колонии. (1×1000) : 300 = 3. Коли-индекс менее 3.

При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют ко- ли-индекс, учитывая весь объем анализируемой воды.

Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100 мл на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3×1000) : 300 = 10. При посеве 10 и 100 мл воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6×1000) : 110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Пример 3. В 100 мл – сплошной рост, в 10 мл – 12 бактерий группы кишечных палочек; коли-индекс равен (12×1000) : 10 = 1200.

12

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество микроорганизмов и коли-индекс воды из водопроводной сети.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы

Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, реактивы. Подробно описать методику проведения работы.

Отобрать пробу воды из водопроводной сети. Записать условия отбора пробы воды (точное месторасположение крана, из которого отобрали пробу; дату отбора пробы с указанием года, месяца, числа и часа; время спуска воды из крана). Провести определение общего количества бактерий и титра кишечной палочки в исследуемой пробе воды. Сравнить полученные показатели с требованиями ГОСТа для питьевой воды. Сделать вывод о качестве исследуемой воды и записать его.

Результаты работы

Записать в отчет о лабораторной работе:

точное месторасположение крана, из которого отбирают пробу;

дату отбора пробы (с указанием года, месяца, числа и часа);

время спуска воды из крана.

Окончательный результат анализа (величину коли-индекса) занести в отчет.

Сравнить полученный показатель с требования ГОСТа для питьевой воды. Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2874-82, если коли-индекс не превышает 3 (коли-титр не ниже 300); общее количество микроорганизмов – не более 100 в 1 мл.

Сделать вывод о качестве исследуемой воды и записать его.

13

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Для чего изучают микрофлору воды? Какие группы микроорганизмов выявляют и в каких случаях?

2.Существует ли разница в методических подходах к изучению воды открытых водоемов и водопроводной сети? Ответ поясните.

3.Как провести отбор проб воды для микробиологического анализа?

4.Каким образом можно хранить и транспортировать отобранные пробы

воды?

5.Каким образом можно определить общее количество микроорганизмов

вводе? Каковы нормативы оценки санитарного состояния воды по показателю ее бактериальной загрязненности?

6.Каким методом можно определить количество бактерий группы кишечных палочек в воде? Каковы его достоинства и недостатки? Какие микробиологические показатели характеризуют интенсивность фекального загрязнения воды?

7.Как провести определение титра бактерий группы кишечных палочек в воде методом мембранных фильтров?

8.Каковы нормативы оценки санитарного состояния воды по титру бактерий группы кишечных палочек?

Лабораторная работа № 2 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОЗДУХА

Воздух закрытых помещений и атмосферный воздух значительно различаются по количественному и качественному составу микроорганизмов. Бактериальная обсемененность воздуха помещений выше, чем атмосферного.

Микрофлора воздуха формируется в основном за счет почвенных микроорганизмов родов Micrococcus, Bacillus Actinomyces, Penicillium, Aspergillus, Mucor и др., отличающихся большой устой-

чивостью к неблагоприятным факторам внешней среды (высушиванию, ультрафиолетовому излучению, колебаниям температуры и пр.). Встречаются и патогенные виды, попадающие в воздух от больных людей и животных воздушно-капельным или воздушно-пылевым путями (при разговоре, кашле, чихании, со слущивающимся эпителием

14

кожных и шерстных покровов, с загрязненного постельного белья и зараженной почвы).

При оценке санитарного состояния воздуха закрытых помещений определяют общее микробное число, а также наличие санитарнопоказательных микроорганизмов (стафилококков, - и - гемолитических стрептококков, являющихся показателями загрязнения воздуха микробиоты носоглотки человека). На биотехнологических предприятиях выявляют наличие и содержание микроорганиз- мов-продуцентов (Candida на заводах по производству белкововитаминных концентратов и гидролизно-дрожжевых заводах, Aspergillus и споровых бактерий на ферментных заводах, Bacillus thuringiensis и сальмонелл – при производстве бактериальных средств защиты растений и т.д.).

Нормативов по оценке бактериальной загрязненности воздуха в настоящее время нет. Согласно «Инструкции санитарномикробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства», воздух производственных помещений считается чистым, если в нем содержится не более 500 микроорганизмов в 1000 л, а в фильтрационном отделении и цехе розлива – не более 50, кроме того, в воздухе отделения чистых культур не должно быть посторонних дрожжей. Воздух, вдуваемый в аппарат чистых культур, не должен содержать посторонних дрожжевых клеток, молочнокислых бактерий, спор плесеней.

При микробиологическом исследовании воздуха следует исходить из основных положений: а) при высоком содержании микроорганизмов в воздухе исследуют небольшие его объемы; б) при низком содержании микроорганизмов или необходимости обнаружения патогенных бактерий и вирусов целесообразно использовать большие объемы воздуха; в) пробы воздуха следует отбирать на уровне дыхания сидящего или стоящего человека.

Для исследования микрофлоры воздуха используют различные методы [1-4].

15

Методы, основанные на принципе ударно-прибивного действия воздушной струи

Существуют методы, основанные на принципе ударноприбивного действия воздушной струи с использованием специальных приборов, например, аппарата Кротова (см. рисунок).

Аппарат Кротова состоит из цилиндрического корпуса 1, имеющего съемную крышку 9. На основании прибора 2 установлен мотор 3. На оси мотора укреплен центробежный вентилятор 4, внутри ротора которого имеется малая крылатка на шариковом подшипнике. Диск 6 прикреплен к фланцу оси малой крылатки, на диск устанавливают чашку Петри 8 с плотной питательной средой. С помощью трех пружин 7 производят центрирование и фиксацию чашки. В крышку вложен прозрачный диск из плексигласа 11, имеющий клиновидную щель 12. В центре основания прибора 2 укрепляют штуцер с диафрагмой 14. Воздух, идущий через штуцер, проходит через выходную трубку 15, соединенную с микроманометром.

Аппарат Кротова [3]:

1 – цилиндрический корпус; 2 – основание прибора; 3 – электромотор; 4 – центробежный вентилятор; 5 – восьмилопастная крыльчатка;

6 – диск; 7 – пружины; 8 – чашка Петри; 9 – крышка прибора; 10 – накидные замки; 11 – диски из плексигласа;

12 – клиновидная щель; 13 – разрезное кольцо; 14 – штуцер с диафрагмой; 15 – выводная трубка

16

При вращении вентилятора воздух засасывается через щель крышки, ударяется о поверхность питательной среды. В результате удара находящиеся в воздухе аэрозоли, в том числе пылевые частицы и капли, содержащие микроорганизмы, прибиваются к поверхности плотной питательной среды. Вращение чашки гарантирует равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды, находящейся в чашке.

Аппарат Кротова прост в работе, эффективен для улавливания микрофлоры в пылевой фазе аэрозоля, дает четкие сопоставимые результаты, за короткое время позволяет произвести отбор проб воздуха непосредственно на чашки со средами. Основной недостаток прибора состоит в том, что он нуждается в электропитании, и это ограничивает его применение для исследования атмосферного воздуха [4, 5].

Седиментационный метод

Метод Коха основан на оседании микроорганизмов под действием силы тяжести на поверхности питательной среды открытой чашки Петри.

При посеве воздушной микрофлоры методом Коха чашку Петри с плотной питательной средой открывают и выставляют на горизонтальную поверхность на уровне дыхания сидящего или стоящего человека. Чашки с мясопептонным или питательным агаром экспонируют на воздухе от 5 до 15 мин., а с дифференциальнодиагностическими средами – от 30 мин. до 1-3-х ч. в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Затем чашку Петри с плотной питательной средой закрывают крышкой, переносят в термостат и инкубируют в условиях, благоприятных для развития выделяемых микроорганизмов.

При использовании метода Коха проводят количественный учет микроорганизмов в воздухе по методу В.Л. Омелянского, который по-

лагал, что на поверхность 100 см2 питательной среды за 5 мин. оседает такое количество клеток микроорганизмов, которое содержится в 10 л воздуха.

17

Учитывая общее число выросших колоний из клеток, осевших из воздуха на чашке со средой за 5 мин., можно рассчитать общее количество клеток в 1000 л воздуха по формуле

где Х – количество клеток микроорганизмов в 1000 л воздуха; А – количество колоний, выросших в чашке; В – площадь чашки, см2 (табл. 2);

– время, в течение которого чашка была открыта, мин.; 5 – время экспозиции для осаждения клеток, содержащихся в 10 л

воздуха, мин.; 100 – число для пересчета площади чашки на 100 см2;

100 – число для пересчета 10 л воздуха в 1000 л.

Пример расчета. В чашке Петри диаметром 10 см2 при экспозиции 10 мин. выросло 45 колоний микроорганизмов.

Таким образом, в 1000 л воздуха находится 2866 клеток микроорганизмов.

Таблица 2

Площадь чашки Петри в зависимости от диаметра

Седиментационный метод не точен и абсолютно не пригоден для исследования атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его движения. Он может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют более совершенные приборы или электроэнергия [2, 3].

18

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Ознакомиться с методами микробиологического анализа воздуха. Провести количественный учет бактерий в воздухе закрытых помещений седиментационным методом.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; лупа с 2-5-кратным увеличением спиртовка; маркер; стерильные чашки Петри, колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 °С питательным агаром. Спички.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Разливание стерильной питательной среды

встерильные чашки Петри

1.Развернуть стерильную чашку Петри.

2.Зажечь спиртовку.

3.Флакон с расплавленным и охлажденным до температуры 50±1 °С питательным агаром взять в правую руку и держать в наклонном положении.

4.Мизинцем и безымянным пальцем левой руки прижать ватную пробку к ладони, достать ее из пробирки и держать так во время последующих манипуляций.

5.Края открытого флакона и внутренний конец ватной пробки обжечь в пламени спиртовки.

6.Приоткрыв большим и указательным пальцами левой руки крышку первой чашки Петри, быстро налить в чашку 15-20 мл расплавленного питательного агара, чтобы дно чашки было полностью покрыто.

7.Закрыть крышку чашки Петри и оставить ее на горизонтальной поверхности до тех пор, пока не застынет среда.

19

Проведение микробиологического исследования воздуха Первый этап

1.Чашку Петри с застывшей питательной средой перенести в исследуемое помещение и поставить ее на горизонтальную поверхность на расстоянии около 1,0-1,5 м от поверхности пола.

2.Открыть чашку 10 (точно фиксируя время экспозиции). Крышку одним концом положить на бумагу, в которую чашка была завернута, а другим – на самый край бортика открытой чашки, стараясь не закрыть поверхности питательной среды.

3.Следить за тем, чтобы вблизи чашки не ходили и не разговаривали, так как это может повлиять на получение достаточно объективных данных.

4.Закрыть чашку Петри, подписать фамилии студентов, номер группы и дату посева, завернуть чашку Петри в бумагу, и поместить в термостат (вверх дном) для выращивания колоний микроорганизмов.

5.Посевы инкубировать в термостате при температуре 28-30 °С в течение 48 ч. Учитывая, что некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательный подсчет выросших колоний провести на 5-е сутки.

Второй этап

1.Подсчитать количество выросших колоний микроорганизмов с помощью лупы.

2.Рассчитать общее количество микроорганизмов в 1000 л исследуемого воздуха по формуле, приведенной в краткой теории к занятию.

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество микроорганизмов в воздухе.

20