Пищевая химия. Жирорастворимые витамины. Учебное пособие

Известно, что витамин А стимулирует иммунитет, повышает устойчивость к инфекциям, используется для лечения кожных расстройств. Рекомендуемые суточные нормы витамина А являются предметом дискуссии, они колеблется в разных странах от 600 до 1000 мкг

(табл.4).

Таблица 4 – Рекомендуемая суточная потребность в витамине А в зависимости от возраста в разных странах, мкг/сут.

Применение высоких доз витамина А (3000 мкг и более) представляет опасность, избыток витамина А токсичен. Общепризнанной безопасной суточной дозой считается доза до 1500 мкг. В литературе

11

достаточно сведений о побочных эффектах витамина А, признаками его хронической передозировки являются сухость кожи, растрескивание губ, конъюнктивит, выпадение волос, уменьшение плотности кости, боль в суставах, хроническая головная боль, внутричерепная гипертензия и поражение печени. Перечисленные симптомы связывают с длительным приемом взрослыми препаратов, содержащих более 7500– 15000 мкг этого витамина. Определение конкретной безопасной пороговой дозы для проявления хронической токсичности витамина А осложняется при наличии хронических болезней, злоупотреблении алкоголем, приеме лекарств.

Для измерения витаминной активности ретинола и каротинов используют две системы: ретиноловый эквивалент (РЭ) и международные единицы (МЕ):

1 РЭ = 1 мкг полностью транс-ретинол

=2 мкг полностью транс-β-каротин

=12 мкг полностью транс-каротиноиды

=24 мкг другие провитамины (каротиноиды).

1МЕ =0,3 мкг полностью транс-ретинол

=0,344 мг мкг полностью транс-ретинол ацетат

=0,55 мг мкг полностью транс-ретинол пальмитат.

Промышленностью выпускаются синтетические препараты витамина А в виде уксуснокислого эфира (ретинолацетат) или в виде эфира пальмитиновой кислоты (ретинолпальмитат), как более устойчивые к окислению.

O

R

O

12

Препараты из естественного сырья – концентраты витамина А, получают путем молекулярной дистилляции печеночных жиров рыб и морских зверей. Их выпускают в виде растворов, драже и таблеток. Широкое распространение получили водно-дисперсные препараты витамина А, усвоение которых организмом превосходит жирорастворимые препараты, кроме того, водорастворимые препараты устойчивы при хранении.

Витамин А широко используют для витаминизации многих жиросодержащих продуктов, в том числе и кондитерских изделий. Каротиноиды, как вещества с А-витаминной активностью (табл. 5), применяют в пищевой промышленности в качестве красящих веществ. Благодаря своей растворимости в жирах они пригодны для окрашивания жиров и сыров, в диспергированном виде – сухих смесей для пудингов и жидкостей (лимонадов, сиропов, фруктовых соков, супов, соусов). В цифровой кодификации пищевых добавок в разделе «красители» β-каротин имеет номер Е-160а, ликопин – Е-160d, криптоксантин – Е-161c, рубиксантин – Е -161d.

Таблица 5 – Биологическая активность различных соединений с А-витаминной активностью

13

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А

Ретинол и ретинолацетат представляют собой желтые кристаллы, ретинолпальмитат – желтое масло. Витамин А быстро разрушается под действием кислорода воздуха, окислительных агентов и ультрафиолетового света. Кислород воздуха при температуре 120 oС полностью разрушает витамин в течение 4 часов, в отсутствии кислорода витамин А термоустойчив и не разрушается при нагревании до температуры 120 oС. Разрушают витамин перекись водорода и пероксиды, образующиеся в маслах при прогоркании. Второй по разрушающей способности фактор, влияющий на устойчивость концентратов витамина А, является кислый рН среды, поэтому минеральные кислоты легко инактивируют витамин. Для повышения устойчивости в масляные растворы витамина А добавляют антиоксиданты: гидрохинон, лецитин, токоферол, масла богатые токоферолом (соевое масло), сложные эфиры галловой кислоты и фенолы.

Определение содержания витамина А в пищевых продуктах ведут с использованием физико-химических (электронной спектроскопии, флуорометрии, полярографии, изотопного разведения) и биологических методов. Выбор метода определяется целью исследования,

14

свойствами анализируемого материала, предполагаемым содержанием витамина А и каротина и характером сопутствующих примесей. Анализ осложнен тем, что витамин присутствует в пищевых продуктах в различных формах, в свободном и этерифицированном состояниях, в форме цис- и транс-изомеров.

Витамины группы А, как полиены, поглощают свет в видимой и УФ-областях, фактически все они имеют окраску от желтой до оранжевой. Поэтому количественный анализ чистых препаратов витамина А основан на измерении поглощения в УФ-области спектра, при условии отсутствия других веществ, поглощающих в этой области. Данный метод мало пригоден в технологии продуктов питания, где чаще используют химические методы с высокой чувствительностью. Витамин А дает цветные реакции с растворами треххлористой сурьмы (голубое окрашивание), треххлористого мышьяка, с дихлоргидрином глицерина (фиолетовое окрашивание). Аналогичное окрашивание дают и другие часто сопутствующие вещества, например β-каротин. Цис-, трансизомеры не различимы при использовании химических методов.

В случае анализа сложных смесей, какими являются продукты питания, для отделения веществ, мешающих определению А-витаминной активности, необходимо провести следующие подготовительные стадии: щелочной гидролиз (омыление), экстракцию неомыляемой части хлороформом и последующее определение оптической плотности растворов либо по цветной реакции, либо путем прямого измерения поглощения света в ультрафиолетовой области. Оба эти способа дают совпадающие между собой результаты при условии применения соответствующего коэффициента перевода экстинкции на биологическую активность в международных единицы активности витамина А в виде ретинола.

15

Лабораторная работа 1. Прямой спектрофотометрический метод определения витамина А

Для количественного определения веществ, обладающих А- витаминной активностью, используют метод прямой спектрофотометрии, основанный на способности этих соединений к избирательному светопоглощению при разных длинах волн в ультрафиолетовой области спектра. Метод прямой спектрофотометрии отличается простотой, высокой специфичностью, дает хорошие результаты при определении содержания витамина А в объектах, не содержащих примесей, обладающих поглощением в той же области спектра. При наличии мешающих определению веществ, необходима дополнительная стадия хроматографического разделения.

Адсорбционный максимум для витамина А лежит при 312– 401 нм и обусловлен присутствием сопряженных кратных связей. Сопоставляя величину экстинкции стандартного раствора (или пользуясь калибровочным графиком) рассчитывают массовую долю витамина А в анализируемом растворе.

Определение витамина А в ретинолацетате и пальмитате

Ход анализа. Точную навеску концентрата витамина А (0,1 г) растворить в 30 мл абсолютного этилового спирта и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл. Довести объем раствора до метки этиловым спиртом и перемешать. В мерную колбу вместимостью 50 мл отобрать пипеткой такой объем разведенного препарата (табл. 6), чтобы конечный раствор имел массовую концентрацию ретинол ацетата (или ретинол пальмитата) 0,3 мкг/мл (или 8-10 МЕ/мл).

Объем калибровочных растворов довести до метки раствором этилового спирта, перемешать и измерить оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кюветах с длиной оптиче-

16

ского пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать растворитель – этиловый спирт.

Таблица 6 – Схема разведения концентрата витамина А (в масле)

где А – оптическая плотность анализируемого раствора; V1 – объем раствора после первого разведения, 100 мл; V2 – объем раствора после второго разведения, 50 мл;

V – объем раствора первого разведения, взятого для приготовления второго разведения (табл.6), мл;

m – навеска исследуемого препарата, г;

E11cv% – удельный показатель поглощения (при 326 нм) для 100% раство-

ра ретинол ацетата и ретинол пальмитата в абсолютном спирте, 1550 и 975, соответственно.

В качестве растворителя вместо абсолютного этилового спирта можно использовать циклогексан. Способ подготовки пробы аналогичен. Оптическую плотность анализируемого раствора измерить на

2 Для обозначения очень низких концентраций используют единицу измерения промилли (млн–1 ; ppm), которая соответствует одной миллионной числа или десятитысячной процента. 1ppm = млн–1 = 10-4 %=мкг/г=1 г/т

17

спектрофотометре при длине волны 327,5 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм, в качестве раствора сравнения использовать циклогексан.

Определение содержания витамина А в рыбьем жире

Ход работы. В конической колбе вместимостью 100 мл взвесить на аналитических весах точную навеску жира (около 1 г), прилить 30 мл этилового спирта, не содержащего альдегидов, и 3 мл 50 % раствора гидрооксида калия. Для омыления жира колбу соединить с обратным холодильником и поместить в водяную баню (с температурой 85–90 оС). Спустя 30 мин колбу с гидролизатом охладить, добавить 50 мл воды и перелить содержимое в делительную воронку.

Полученный гидролизат, содержащий неомыляемую фракцию, трижды экстрагировать диэтиловым эфиром, используя по 50 мл экстрагента. Эфирные вытяжки объединить, собрать в другую делительную воронку и трижды промыть дистиллированной водой до нейтральной пробы по фенолфталеину. К нейтрализованным эфирным вытяжкам добавить в качестве осушителя свежепрокаленный сернокислый натрий (8 г) и выдержать в темном месте в течение 30 мин. Осушитель отфильтровать через воронку Шотта и промыть осадок на фильтре несколько раз диэтиловым эфиром (порции по 10 мл). Фильтраты объединить, собрать в круглодонную колбу и отогнать растворитель на ротационном вакуумеом испарителе при температуре не выше 40 оС в инертной атмосфере

После отгонки диэтилового эфира неомыляемый остаток растворить в абсолютном этиловом спирте до получения раствора с содержанием витамина А 8 ME/мл. Невитаминизированный рыбий жир должен содержать не менее 350 ME/г; витаминизированный рыбий жир

– 1000 ME/ г ретинола. Измерить оптическую плотность спиртового раствора на спектрофотометре в кювете с длиной оптического пути 10 мм

18

при длинах волн 311, 324,5 и 334 нм. Массовую долю витамина А (СА, МЕ/г) вычислить по формуле

C= Aисп × n ×1850 ,

Аm ×100

где А исп = 7 А324,5 – 2,912 А311 – 4,088 А334 ;

А324,5 , А311, А334 – оптические плотности раствора при длинах волн 324,5, 311 и 334 нм, соответственно;

n – разведение ;

m – навеска жира, г;

1850 – коэффициент перевода в МЕ.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

абсолютный этиловый спирт, ретинол ацетат (или 3–8 % масляный раствор ретинолацетата), ретинол пальмитат (или 55 % масляный раствор ретинолпальмитат), 50 % раствор гидроксида калия, 95 % этиловый спирт (не содержащий альдегидов), диэтиловый эфир, сернокислый натрий (прокаленный);

мерные колбы вместимостью 50, 100 мл, пипетки, обратный холодильник. делительные воронки, пробирки, перегонные колбы, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

аналитические весы; водяная баня (550С), ротационный вакуумный испаритель, спектрофотометр (λ=326 нм).

Лабораторная работа 2. Фотоколориметрические методы определения витамина А

Витамин А дает окрашенные соединения сложной структуры с треххлористой сурьмой, треххлористым мышьяком, дихлоргидрином глицерина. На практике для количественного анализа продуктов, содержащих витамин А, используют метод Карра-Прайса.

19

Определение витамина А по реакции с хлоридом сурьмы

В основе метода Карра-Прайса лежит цветная реакция хлороформного экстракта витамина А, с раствором треххлористой сурьмы в присутствии уксусного ангидрида. В результате водоотнимающего действия хлорида сурьмы витамин А превращается в соединение сложного состава синего цвета с максимумом поглощения при 620 нм. Качественная реакция хлорида сурьмы с веществами, обладающими А-витаминной активностью, не специфична – аналогичное окрашивание дают все соединения с сопряженными связями. Образующаяся синяя окраска не стабильна, и переходит со временем в розово-фиолетовую, что осложняет анализ и требует строго соблюдения времени выдерживания до фотометрирования. Кроме того, присутствие влаги в реакционной смеси даже в незначительном количестве вызывает гидролиз хлорида сурьмы до хлороксида сурьмы, который не реагирует с витамином А, а вызывает помутнение смеси. Поэтому для устранения следов влаги в реакционную смесь добавляют уксусный ангидрид.

Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (3–6 г сухого или 15 г жидкого продукта) растворить в 20 мл дистиллированной воды в круглодонной колбе с пришлифованной пробкой вместимостью 250 мл. После полного растворения навески добавить 40 мл этилового спирта и 5–7 мл 50 % раствора гидроксида калия. Колбу закрыть обратным холодильником и поместить в водяную баню при температуре 85 оС. Для стабилизации витамина А добавить 30–50 мг аскорбиновой кислоты.

Спустя 30 мин колбу с гидролизатом вынуть из бани, охладить и отсоединить холодильник. Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку. Колбу трижды ополоснуть небольшими

20