Пищевая химия. Жирорастворимые витамины. Учебное пособие

лодонную колбу залить хлороформ, подсоединить аппарат Сокслета, обратный холодильник. Экстракцию вести в течение 3 ч до прекращения окрашивания растворителя. После удаления окрашенных соединений пакетик с навеской высушить в вытяжном шкафу до удаления запаха хлороформа.

Содержимое пакетика количественно перенести в круглодонную колбу, добавить 60 мл метилового спирта и подсоединить обратный холодильник. Поместить колбу на кипящую водяную баню и выдержать в течение 30 мин. Полученный экстракт слить в мерную колбу вместимостью 200 мл, а экстракцию повторить дважды с новым количеством спирта. Спиртовые экстракты объединить, довести объем раствора до метки тем же растворителем и отфильтровать.

Отобрать 10 мл фильтрата в круглодонную колбу и отогнать растворитель на ротационном вакуумном испарителе досуха. Остаток растворить в 1 мл метилового спирта и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл. Для этого колбу ополоснуть трижды небольшими порциями безводного ацетона и довести объем раствора до метки, используя безводный ацетон. Полученный метанольноацетоновый раствор отфильтровать.

На проведение цветной реакции отобрать 2 мл метанольноацетонового фильтрата в фотоколориметрическую кювету, добавить 8 мл свежеприготовленного лимонно-борного реактива и выдержать смесь в темном месте в течение 10 мин. Измерить оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 470 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать безводный ацетон.

Контрольный раствор на окраску. Отмерить в фотоколоримет-

рическую кювету 2 мл исследуемого метанольно-ацетонового фильтрата и 8 мл безводного ацетона. Измерить оптическую плотность контрольного раствора при аналогичных условиях.

101

Из величины оптической плотности анализируемого раствора вычесть значение оптической плотности для контрольного раствора. По калибровочному графику определить концентрацию флавонолов в анализируемой пробе. Массовую долю флавонолов (СБФ, мг %) рассчитать по формуле

где С – концентрация флавонолов в анализируемом растворе, найденная по калибровочному графику, мкг/мл;

V1 – общий объем метанольного экстракта, 200 мл;

V2 – объем метанольного экстракта, взятого на анализ, 10 мл; V3 – объем метанольно-ацетонового раствора, 25 мл;

V4 – объем метанольно-ацетонового фильтрата, взятого на цветную реакцию, 2 мл; 100 – коэффициент пересчета в мг %;

1000 – коэффициент пересчета в мг; m – навеска исследуемого материала, г.

Построение калибровочного графика. Точную навеску (10 мг)

многократно перекристаллизованного рутина растворить в 4 мл абсолютного метилового спирта и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл, используя сухой ацетон. Из стандартного раствора рутина приготовить в шести градуированных пробирках калибровочные растворы с массовой концентрацией 1–10 мкг/мл по схеме, приведенной в табл. 27. Измерить оптическую плотность калибровочных растворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 470 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать безводный ацетон.

Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А470) – концентрация флавонола (СБФ, мкг/мл).

102

Таблица 27 – Схема приготовления калибровочных растворов флавонолов

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

перекристаллизованный рутин, метиловый и этиловый спирт (абсолютный), хлороформ, безводный ацетон, лимонно-борный реактив;

пипетки; круглодонные колбы, обратные холодильники, нисходящие холодильники, водяная баня, аппарат Сокслета, мерные колбы вместимостью 25, 200 мл, градуированные пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм;

аналитические весы; фотоэлектроколориметр (λ 470 нм).

Лабораторная работа 9. Спектрофотометрический метод определения флавононов и суммы флавонолов и флавонов

Для количественного анализа флавоноидов: флавонолов (рутина, кверцетина), флавонов (апигенина, лютеолина, изовитексина) и флавононов (нарингенин, дигидрокверцетин), используют спектрофотометрический метод, в основе которого лежит определение продуктов взаимодействия флавонолов и флавонов с раствором хлорида алюминия (при длине волны 415 нм), и флаванонов с 2,4-динитрофенилгидразином (при длине волны 495 нм).

103

Флавоны и флавонолы при взаимодействии с хлоридом алюминий образуются кислотоустойчивые комплексы по кето-группе при С4 и гидроксильным группам при С3, и С5, имеющие максимум поглощения в диапазоне длин волн 415–440 нм. При этом, они, имея кратную связь между С2– С3, не взаимодействуют с 2, 4-динитрофенилгидразином, в то время как, флаваноны образуют с последним по карбонильной группе 2, 4-динитрофенилгидразоны, имеющие максимум поглощения при длине волны 495 нм.

Ход анализа. В плоскодонную колбу со шлифом внести навеску гомогенизированного продукта (1,0 г), добавить 30 мл подкисленного 90 % раствора этилового спирта, подсоединить обратный холодильник и поместить колбу на кипящую водяную баню. Спустя 30 мин экстракт охладить, надосадочную жидкость перелить в мерную колбу вместимостью 100 мл, а осадок залить новой порцией экстрагента (30 мл подкисленного 90 % раствора этилового спирта). Экстракт охладить, отфильтровать через воронку Шотта и промыть осадок на фильтре раствором этанола. Фильтраты собрать в мерной колбе вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки раствором этилового спирта.

В градуированную пробирку вместимостью 5 мл внести 0,5 мл экстракта, добавить 1,5 мл 95 % раствора этанола, 0,1 мл 10 % раствора хлорида алюминия, 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин и измерить оптическую плотность анализируемого раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив анализируемый экстракт на 0,5 мл дистиллированной воды.

По величине оптической плотности определить по калибровочному графику для кверцетина концентрацию суммы флавонолов и фла-

104

вонов. Массовую долю суммы флавонолов и флавонов (СФ, мг %) в анализируемой пробе рассчитать по формуле

C= CK ×V1 ×10

Фm ×V2

где СК – концентрация суммы флавонолов и флавонов, найденная по калибровочному графику для кверцетина, мкг/мл;

V1 – общий объем экстракта, 100 мл;

V2 – объем экстракта, взятый на проведение цветной реакции, 0,5 мл; 10 – коэффициент пересчета в мг%;

m – масса навески исследуемого материала, г.

Для определения флавононов в градуированную пробирку вместимостью 5 мл внести новую порцию 0,5 мл экстракта анализируемого образца, добавить 1,5 мл 95 % раствора этанола, 0,1 мл раствора 2, 4- динитрофенилгидразина (10 мг/мл), 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин и измерить оптическую плотность калибровочного раствора на спектрофотометре при длине волны 495 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив анализируемый экстракт на 0,5 мл дистиллированной воды.

По величине оптической плотности определить по калибровочному графику для нарингенина концентрацию флавононов. Массовую долю флавононов (С’Ф, мг %) в анализируемой пробе рассчитать по формуле

где СК – концентрация флавононов, найденная по калибровочному графику для нарингенина, мкг/мл;

V1 – общий объем экстракта, 100 мл;

V2 – объем экстракта, взятый на проведение цветной реакции, 0,5 мл;

105

10 – коэффициент пересчета в мг%;

m – масса навески исследуемого материала, г.

Построение калибровочного графика кверцетина. Из стандарт-

ного раствора кверцетина (100 мкг/мл) в мерных колбах вместимостью 25 мл приготовить 4 калибровочных раствора с концентрацией 20, 40, 60 и 80 мкг/мл. Отобрать пипеткой в мерные колбы соответственно 5, 10, 15, 20 мл рабочего раствора кверцетина и довести объемы калибровочных растворов до метки 80 % раствором этанола.

В четыре градуированные пробирки вместимостью 5 мл внести по 0,5 мл соответствующего калибровочного раствора кверцетина, добавить 1,5 мл 95 % раствора этанола, 0,1 мл 10 % раствора хлорида алюминия, 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин и измерить оптическую плотность калибровочных растворов на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив калибровочный раствор на 0,5 мл дистиллированной воды. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А415) – содержание кверцетина

(СКВ, мкг/мл).

Построение калибровочного графика нарингенина. Из стан-

дартного раствора нарингенина (20 мг/мл) в мерных колбах вместимостью 25 мл приготовить 3 калибровочных раствора с концентрацией 800, 1000 и 2000 мкг/мл. Отобрать пипеткой в мерные колбы соответственно 1,0; 2,5; 5,0 мл рабочего раствора нарингенина и довести объемы калибровочных растворов до метки 80 % раствором этанола.

В три градуированные пробирки вместимостью 5 мл внести по 0,5 мл соответствующего калибровочного раствора нарингенина, добавить 1,5 мл 95 % раствора этанола, 0,1 мл раствора 2, 4-динитрофенилгидразина (10 мг/мл), 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллиро-

106

ванной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин и измерить оптическую плотность калибровочных растворов на спектрофотометре при длине волны 495 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы заменив калибровочный раствор на 0,5 мл дистиллированной воды. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А495) – содержание нарингенина (СНА, мкг/мл).

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

метанол (ос.ч.), спирт этиловый ректифицированный (95 %), 10 % спиртовый раствор хлористого алюминия (AlCl3·6H2O), 1 % раствор 2,4-динитрофенилгидразин, 1 % спиртовый раствор гидроксида натрия (на 70 % метаноле), 1 М раствор ацетата натрия;

пипетки; конические колбы со шлифом, обратные холодильники, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, градуированные пробирки, спектрофотомтетрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм;

спектрофотометр с длиной волны 190–900 нм, аналитические весы, водяная баня.

Стандартный раствор кверцетина (100 мкг/мл). Навеску квер-

цетина (10 мг) растворить в 20 мл 80 % раствора этанола, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем.

Стандартный раствор нарингенина (20мг/мл). Навеску нарин-

генина (1 г) растворить в 20 мл 80 % раствора этанола, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем.

Раствор 2, 4-динитрофенилгидразин (10 мг/мл). Навеску 1 г ди-

нитрофенилгидразина растворить в 2 мл 96 % серной кислоты и количе-

107

ственно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл с использованием метанола, довести объем раствора до метки тем же растворителем.

Подкисленный раствор этилового спирта. К 99,5 мл охлаж-

денному 95 % раствора этилового спирта осторожно по стенке прилить 0,5 мл концентрированной серной кислоты.

Контрольные вопросы

1.Что понимается под термином «витаминоподобные» вещества? Какие витаминоподобные вещества известны?

2.Почему биофлавоноиды называют иногда витамином С2 ? Каким свойством обладают данные полифенолы, сходным с витамином С? Назовите основные пищевые источники витамина Р?

3.Производными, каких соединений являются биофлавоноиды и в чем их различия между собой? Приведите общую формулы для них. Назовите основные представители флавонолов и флаванонов.

4.С какими особенностями в химическом строении связывают антиоксидантные свойства соединений биофлавоноидов? В чем сходство по химическому строению витамина Е с биофлавоноидами?

5.Какие организмы осуществляют первичный синтез биофлавоноидов? В каких тканях они накапливаются и от чего это зависит?

6.Назовите свободные и связанные формы биофлавоноидов. Как они различаются по растворимости и месту расположения в тканях?

7.Какова основная биологическая роль соединений с Р- витаминной активностью? Как проявляется их антиоксидантная способность?

8.Синтезируется ли витамин Р в организме человека? Как проявляется недостаточность витамина или его переизбыток? Какова суточная потребность в витамине Р?

108

9.Приведите пример препаратов, обладающих Р-витаминной активностью, и способы их получения? Какие из них используют для обогащения пищевых продуктов массового потребления?

10.Что представляет собой молекула рутина, и какова его витаминная активность? Существует ли связь между рутином и витамином С? Назовите природные источники рутина.

11.Укажите области применения дигидрокверцетина как антиоксиданта? С чем связан интерес к дигидрокверцетину? Назовите способы получения его.

12.Каковы физические свойства биофлавоноидов? Опишите их окраску, способность к растворению, устойчивость.

13.Приведите методы количественного определения веществ с Р- витаминной в продуктах питания. В чем заключается процесс пробоподготовки при анализе?

109

2.2 ХОЛИН

Холин (витамин В4 или Вр) – это гидроксид-2-гидроксиэтил- (триметил) аммония, его название происходит от греческого слова kholy – желчь.

Он хорошо растворим в воде, является сильным основанием, образует соли с кислотами, наиболее распространенная соль – холинхлорид, которая широко применяется в фармакологии. Холин входит в состав важнейших фосфолипидов – лецитинов и сфингомиелинов, являющихся липидными компонентами клеточных мембран, а в нервных клетках составляют половину чувствительного миелинового слоя.

Не все млекопитающие обладают способностью синтезировать витамин В4, однако человек, некоторые животные и микроорганизмы способны к выработке холина. Синтез холина у млекопитающих протекает в печени ступенчато из фосфатидилсерина, в качестве донора метильных групп выступает метионин. Дополнительное количество холина синтезируется микрофлорой кишечника человека при участии аминокислот: метионина, серина, и витаминов В12 и В9, снижая долю эндогенного холина до одной пятой от суточной потребности в нем. Строго говоря, холин не является витамином, поскольку синтезируется в организме и используется как пластическое вещество при построении клеточных мембран. Однако в силу ограниченности синтеза метильных групп, холин относят к псевдовитаминам и его основная масса должна поступать с пищей.

110