Специальная микробиология. Лабораторный практикум

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

К а ф е д р а «Технология пищевых производств и биотехнология»

Е.Ю. РУДЕНКО

СПЕЦИАЛЬНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Лабораторный практикум

Самара Самарский государственный технический университет

2019

1

Печатается по решению ученого совета ФПП СамГТУ (протокол № 9 от

27. 04. 2018 г.)

УДК 579:663 ББК 28.4:36-1я73 Р 83

Руденко Е.Ю.

Р 83 Специальная микробиология: лабор. практикум / Е.Ю. Руденко. –

Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2019. – 88 с.

Рассмотрены методы микробиологического анализа пивных дрожжей и пива, молока, кисломолочных продуктов, сливочного масла, колбасы, сыра, воды, воздуха и смывов.

Материал предназначен для студентов, обучающихся по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология»; может быть интересен для преподавателей, специалистов пищевой промышленности, научных работников и аспирантов.

Рецензент канд. хим. наук, доцент Г.С. Муковнина

УДК 579:663 ББК 28.4:36-1я73 Р 83

2

ВВЕДЕНИЕ

В лабораторном практикуме рассмотрены методы микробиологического анализа пивных дрожжей и пива, молока, кисломолочных продуктов, сливочного масла, колбасы, сыра, воды, воздуха и смывов.

Лабораторный практикум предназначен для студентов факультета «Пищевых производств», обучающихся по направлению подготовки 19.03.01 «Биотехнология», и выполнен в соответствии с требованиями образовательного стандарта для данного направления. Лабораторный практикум по курсу «Специальная микробиология» включает некоторые лабораторные работы, которые ранее входили в лабораторный практикум по курсу «Общая биология и микробиология».

Практикум включает девять лабораторных работ по основным разделам курса «Специальная микробиология». Каждая лабораторная работа содержит краткие теоретические сведения, экспериментальную часть и контрольные вопросы.

3

Лабораторная работа № 1 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ И ПИВА

Отбор проб

Пробы для микробиологического анализа отбирают с соблюдением условий, исключающих вторичное обсеменение посторонними микроорганизмами.

Пробу пастообразных и жидких продуктов из большой емкости отбирают с разной глубины. Пробу переносят в посуду, горлышко которой фламбируют.

При отборе пробы жидкости из емкостей, оснащенных краном, кран промывают, вытирают ватным тампоном, пропитанным этиловым спиртом, и обжигают в пламени факела или спиртовки; сливают часть жидкости (от 1 до 10 л в зависимости от вместимости резервуара и диаметра крана); пробу отбирают в стерильную посуду, горлышко которой предварительно фламбируют.

Масса или объём пробы должны быть достаточны для выполнения всего комплекса микробиологических исследований. На анализ отбирают: не менее 1 шт. – от продуктов в потребительской упаковке; до 500 мл (г) – жидких, пастообразных, сыпучих продуктов.

Отобранная проба предназначена для приготовления разведений или непосредственного посева в питательные среды.

Отобранные пробы переносят в лабораторию и приступают к их микробиологическому анализу. Если нет возможности сразу приступить к исследованиям отобранных образцов, их помещают в холодильник при температуре от 0 до 5 ° С не более чем на 6 ч [2, 10, 13].

Пивные дрожжи

Отбор проб семенных дрожжей производят из каждой емкости. Пробы отбирают с разных уровней чистой пипеткой с расширенным концом или стеклянной трубкой и помещают в пробирки или небольшие колбочки.

4

Всеменных дрожжах методом микроскопирования определяют упитанность по гликогену, процент нежизнеспособных дрожжевых клеток и содержание бактерий. При микроскопировании обращают внимание на морфологию дрожжевых клеток. Наличие заостренных или сильно удлиненных клеток свидетельствует о дегенерации культуры или о заражении дикими дрожжами.

Всеменных дрожжах количество бактерий не должно превышать 1 % от общего числа дрожжевых клеток; количество нежизнеспособных дрожжевых клеток должно быть в пределах 5 %; 70–75 % дрожжей должны содержать гликоген. Дрожжи, не отвечающие данным требованиям, необходимо подвергать антисептической обработке [2, 10, 13].

Готовое пиво

Непосредственно перед вскрытием бутылок с пивом их перемешивают 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговым движением. После вскрытия горлышко стеклянных бутылок обжигают и отбирают пиво в объеме, необходимом для проведения анализа.

Согласно требованиям ИК 10-04-06-140-87 («Инструкция сани- тарно-микробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства»): в готовом пиве определяют общее число микроорганизмов на питательном агаре и наличие бактерий группы кишечных палочек. Общее число микроорганизмов в 1 мл пива не должно превышать 500 клеток. Бактерии группы кишечных палочек должны отсутствовать в 1 мл разливного пива [2, 10, 13].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа пивоваренного производства.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бакте-

5

риологическая петля; пинцет; маркер; резиновая груша; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные инструменты: пипетки вместимостью 1 и 10 мл; чашки Петри; колба вместимостью 100 мл, закрытая ватной пробкой.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке с крышкой вместимостью 100 мл; физиологический раствор в капельнице для приготовления препарата; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри.

Семенные пивные дрожжи в пробирке, закрытой ватной пробкой; проба пива в пластиковой бутылке.

Растворы: карболового генцианвиолета; раствора Люголя; раствора водного фуксина; 96 %-ного этанола; метиленового синего 1:40 в капельницах.

Стерильный 10 %-ный раствор карбоната натрия в колбе вместимостью 100 мл.

Пробирки с 9 мл стерильной водопроводной воды или 0,1 %-ным раствором пептона; пробирка с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Универсальная индикаторная бумага; спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Приготовление постоянного препарата для определения микробиологической чистоты семенных дрожжей

1. Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

6

2.Зажечь спиртовку.

3.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

4.Погрузить петлю в пробирку с исследуемыми семенными дрожжами.

5.Перенести взятую каплю семенных дрожжей на предметное стекло и равномерно размазать петлей на площади 1–2 см2 как можно более тонким слоем, не затрагивая краев предметного стекла.

6.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя, и поместить в штатив.

7.Погасить спиртовку.

8.Мазок высушить на воздухе.

9.Зажечь спиртовку, зафиксировать мазок над пламенем и погасить спиртовку.

10.Сверху на препарат положить полоску фильтровальной бумаги.

11.На фильтровальную бумагу налить раствор водного фуксина

иокрашивать 3 мин.

12.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промыть струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

13.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой.

Определение микробиологической чистоты семенных дрожжей

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х).

2.Подсчитать количество бактерий не менее чем в 5 полях зрения.

3.Количество клеток бактерий выразить в процентах от общего числа подсчитанных клеток.

4.Результат подсчета записать в отчет.

5.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

7

Приготовление прижизненного препарата для определения нежизнеспособных клеток семенных дрожжей

1.Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

4.Погрузить петлю в пробирку с исследуемыми семенными дрожжами.

5.Перенести взятую каплю семенных дрожжей на предметное стекло.

6.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя, и поместить в штатив.

7.Погасить спиртовку.

8.К суспензии клеток на предметном стекле добавить каплю метиленового синего 1:40.

9.Покровное стекло протереть хлопчатобумажной тканью и поместить на клеточную суспензию так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха.

10.При необходимости удалить излишки жидкости полоской фильтровальной бумаги.

11.Через 2 мин промикроскопировать препарат.

Определение нежизнеспособных клеток семенных дрожжей

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х).

2.Подсчитать количество нежизнеспособных дрожжей не менее чем в 5 полях зрения. Нежизнеспособные дрожжи окрашиваются в синий цвет вследствие того, что клеточная оболочка и мембрана мертвых клеток не препятствует проникновению краски.

8

3.Количество нежизнеспособных дрожжевых клеток выразить в процентах от общего числа подсчитанных клеток.

4.Результат подсчета записать в отчет.

5.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Приготовление прижизненного препарата для определения содержания гликогена в семенных дрожжах

1.Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

4.Погрузить петлю в пробирку с исследуемыми семенными дрожжами.

5.Перенести взятую каплю семенных дрожжей на предметное стекло.

6.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя, и поместить в штатив.

7.Погасить спиртовку.

8.К суспензии клеток на предметном стекле добавить каплю раствора Люголя.

9.Покровное стекло протереть хлопчатобумажной тканью и поместить на клеточную суспензию так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха.

10.При необходимости удалить излишки жидкости полоской фильтровальной бумаги.

Клетки, не содержащие гликогена, приобретают лимонно-желтую окраску, а клетки с гликогеном – красно-бурую или коричневую.

9

Определение содержания гликогена в семенных дрожжах

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х).

2.Подсчитать количество дрожжевых клеток, содержищих гликоген, не менее чем в 5 полях зрения.

3.Количество дрожжевых клеток, содержищих гликоген, выразить в процентах от общего числа подсчитанных клеток.

4.Результат подсчета записать в отчет.

5.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Вскрытие упаковки с пробой продукта

Пробку бутылки с пробой пива протереть тампоном, смоченным 70 %-ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

Непосредственно перед вскрытием пиво в бутылке перемешать 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговым движением [10].

Отбор навески из пробы

10 мл пива пипеткой перенести – в стерильную, закрытую ватной пробкой стеклянную колбу вместимостью 100 мл и подогреть при частом перемешивании круговыми движениями на водяной бане при температуре от 30 до 37 ° С до тех пор, пока из него не перестанут выделяться пузырьки газа.

После этого пиво тщательно перемешать осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку и отобрать 1 мл стерильной пипеткой путем введения пипетки в глубину продукта.

Часть пива, оставшуюся на поверхности пипетки, оставить стечь к острию пипетки. Образующуюся каплю удалить прикосновением к внутренней стенке посуды над поверхностью продукта [10, 13].

Приготовление десятикратного разведения пива

Стерильной пипеткой внести 1 мл пива в 9 мл стерильной водопроводной воды или 0,1 %-ного раствора пептона, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой пипеткой

10