Специальная микробиология. Лабораторный практикум

Приложение 2

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗВЕДЕНИЙ [9]

1.Для получения десятикратного разведения (1:10) жидкого пищевого продукта стерильной пипеткой внести 10 мл продукта в колбу с 90 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать круговыми движениями.

Для получения первого десятикратного разведения (1:10) твердого пищевого продукта к навеске продукта массой 10±0,1 г добавить 90 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора. Смесь перемешать или гомогенизировать стерильным фарфоровым пестиком до получения однородной консистенции продукта. Если при гомогенизации продукта получена неоднородная масса, то отстоять ее в течение 15 мин и для посева и (или) приготовления разведений использовать надосадочную жидкость.

Таким образом, получается разведение продукта в 10 раз (10-1 разведение),

в1 мл которого содержится 0,1 г продукта.

2.Для получения разведения продукта в 100 раз (10-2 разведение), в 1 мл которого содержится 0,01 г продукта, стерильной пипеткой взять 1 мл из 10-1 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

3.Для получения разведения продукта в 1000 раз (10-3 разведение), в 1 мл которого содержится 0,001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-2 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

4.Для получения разведения продукта в 10000 раз (10-4 разведение), в 1 мл которого содержится 0,0001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-3 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

5.Для получения разведения продукта в 100000 раз (10-5 разведение), в 1 мл которого содержится 0,0001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-4 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхно-

81

сти раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

6.Для получения разведения продукта в 1000000 раз (10-6 разведение), в 1 мл которого содержится 0,00001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-5 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

7.Для получения разведения продукта в 10000000 раз (10-7 разведение), в 1 мл которого содержится 0,000001 г продукта, стерильной нагретой пипеткой взять 1 мл из 10-6 разведения и внести в пробирку с 9 мл стерильного раствора хлористого натрия или пептонно-солевого раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

Интервал между приготовлением навесок продукта, их разведений и посева в питательные среды не должен превышать 30 мин.

При посеве в чашки Петри посевной материал вносить от большего разведения к меньшему. В этом случае можно пользоваться одной пипеткой.

82

Приложение 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МЕЗОФИЛЬНЫХ АЭРОБНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

(КМАФАНМ) [5, 10]

Первый этап

1.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (45±1)

°С питательным агаром.

2.Посевы инкубировать в термостате при температуре (30±1) ° С в течение

(72±3) ч.

Второй этап

1. Подсчитать количество колоний, выросших на чашках Петри.

Для подсчета отобрать чашки Петри, на которых выросло от 15 до

300колоний.

2.По результатам подсчета вычислить среднее арифметическое значение числа колоний из всех посевов одного разведения.

Если число колоний в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений соответствует требованиям, то вычислить среднее арифметическое количество микроорганизмов в каждом из этих отдельных разведений.

Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 pазa, то оценку провести по результатам посева наибольшего разведения.

Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний меньше 15 или больше 300, эти результаты использовать для подсчета среднеарифметического значения и при соответствии полученного значения интервалу от 15 до 300 его использовать для дальнейших расчетов.

3.Количество микроорганизмов в 1,0 г (мл) продукта вычисляютпо формуле:

Результаты определения количества мезофильных аэробных и факульта- тивно-анаэробных микроорганизмов записать следующим образом: «КМАФАнМ … ( число от 1,0 до 9,9 х 10n) КОЕ/г».

83

Приложение 4

ВЫЯВЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК (БГКП) [6, 10] Первый этап

1. Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) ° С в течение

24–48 ч.

Второй этап

1.Посевы просмотреть через (24+3) ч, отметить положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет провести через (48±3) ч.

Положительными считать посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды и образовании газа.

2.При необходимости для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к БГКП сделать пересевы на поверхность среды Эндо.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) ° С в течение

(24±3) ч.

Третий этап

1.Просмотреть посевы и отметить рост характерных колоний: бледнорозового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

2.При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к БГКП из чашек Петри с посевам отобрать не менее чем по 5 колоний. Из каждой отобранной колонии приготовить мазок окрасить по Граму

(прил. 1).

БГКП являются грамотрицательными палочками.

Результаты определения количества колиформных бактерий записать следующим образом:

«БГКП обнаружены в … ( указывается исследуемая масса продукта в г)» или «БГКП в … ( указывается исследуемая масса продукта в г) не обнаружены».

84

Приложение 5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ [4, 10] Первый этап

1.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (45±1) ° С агаризованным солодовым суслом. Параллельно с этим залить в чашку Петри 15–20 мл среды для проверки ее стерильности.

2.Посевы термостатировать при температуре (24+1) ° С в течение 5 сут.

Второй этап

1.Через 5 сут. провести окончательный учет результатов термостатирования посевов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделить визуально.

Рост дрожжей на агаризованных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем.

Развитие плесневых грибов на питательных средах сопровождается появлением мицелия различной окраски.

Если в посевах на агаризованных средах присутствуют мукоровые, очень быстро растущие грибы, то снятие предварительных результатов необходимо провести очень осторожно, не допуская того, чтобы споры этих грибов осыпались и дали рост вторичных колоний.

2.Для количественного подсчета отобрать чашки, на которых выросло от 15 до 150 колоний дрожжей и (или) от 5 до 50 колоний плесневых грибов.

3.При необходимости для разделения колоний дрожжей и плесневых грибов провести микроскопические исследования. Для этого из отдельных колоний приготовить препараты методом раздавленной капли. На предметное стекло нанести каплю физиологического раствора. Затем в эту каплю прокаленной петлей внести часть колонии. Полученную суспензию покрыть покровным стеклом.

Результаты микроскопирования оценить, пользуясь характеристикой дрожжей и плесневых грибов, указанной в табл. П5.1.

4.Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен рост дрожжей и плесневых грибов и их присутствие подтверждено микроскопированием, то дать заключение о присутствии этих микроорганизмов в продукте.

5.Результаты обработать и пересчитать отдельно для дрожжей и плесневых грибов.

6.Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г продукта вычислить по формуле

85

где ΣC – сумма всех подсчитанных колоний на чашках Петри в двух последовательных десятикратных разведениях;

n1 – количество чашек Петри, подсчитанное для меньшего разве дения, т.е. для более концентрированного разведения продукта;

n2 – количество чашек Петри, подсчитанное для большего разведения; n – степень разведения продукта (для меньшего разведения).

Таблица П5.1

Результаты определения количества дрожжей и плесневых грибов записать следующим образом:

–« плесневых грибов … ( число от 1,0 до 9,9 х 10n) КОЕ/г»;

–« дрожжей… ( число от 1,0 до 9,9 х 10n) КОЕ/г».

86

87