Специальная микробиология. Лабораторный практикум

путем десятикратного насасывания и выдувания из него содержимого пробирки с помощью резиновой груши.

Интервал между приготовлением разведения пива и посева в питательные среды не должен превышать 30 мин [10, 13].

Определение общего количества микроорганизмов в пиве Первый этап

1.Одновременно в две стерильные чашки Петри пипеткой высеять по 1 мл десятикратного разведения пива (в каждую чашку). При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывать и посевной материал вносить на дно чашки.

2.Затем в каждую чашку налить (18±2) мл расплавленного и охлажденного до (45±1) ° С питательного агара и немедленно перемешать с посевным материалом осторожными круговыми движениями.

3.После застывания агаризованной среды чашки Петри перевернуть дном вверх и поместить в термостат.

4.Посевы инкубировать при температуре (30±1) ° С в течение

(72±3) ч.

5. Через трое суток чашки Петри с посевами убрать в холодильник до следующего занятия.

Второй этап

1.Подсчитать количество колоний, выросших на чашках Петри. Для подсчета отобать чашки Петри, на которых выросло от 15 до 300 колоний.

2.По результатам подсчета вычислить среднее арифметическое значение числа колоний выросших на двух чашках Петри.

3.Полученные среднеарифметические значения округлить:

–до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;

–до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчиваются цифрой 5;

–до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.

11

4. Количество микроорганизмов в 1,0 мл (г) продукта вычислить по формуле

Результат вычисления выразить числом от 1,0 до 9,9 х 10n.

Результаты определения общего числа микроорганизмов за-

писать следующим образом: «Общее число микроорганизмов … КОЕ/мл».

Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует, то результат выразить следующим образом: «Общее число микроорганизмов < 1 КОЕ/мл».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, меньше 15, результаты записать следующим образом: «Общее число микроорганизмов < (15 · n/V) КОЕ/мл».

Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300, то результат выразить следующим образом: «Общее число микроорганиз-

мов > (300 · n/V) КОЕ/мл» [10, 13].

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пиве Первый этап

1.Пиво, находящееся в стеклянной колбе вместимотью 100 мл, после удаления из него углекислого газа, нейтрализовать стерильным 10 %-ным раствором карбоната натрия, добавляя его из стерильной пипетки, до рН 7. Реакцию среды проверить с помощью универсальной индикаторной бумаги.

2.1 мл пива стерильной пипеткой внести в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) ° С

втечение 24–48 ч.

12

Второй этап

1. Посевы просмотреть через (24+3) ч, отметить положительные посевы в жидкие среды, а окончательный учет проводить через

(48±3) ч.

Положительными считать посевы в жидкие среды, в которых имеет место интенсивный рост микроорганизмов, проявляющийся в помутнении среды и образовании газа.

2.При необходимости для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на жидких средах, к БГКП сделать пересевы на поверхность среды Эндо.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (36±1) ° С

втечение (24±3) ч.

Третий этап

1.Просмотреть посевы и отметить рост характерных колоний: бледно-розового или красного цвета, часто с металлическим блеском.

2.При необходимости подтверждения принадлежности выросших микроорганизмов к БГКП из чашек Петри с посевами отобрать не менее чем по 5 колоний. Из каждой отобранной колонии приготовить мазок и окрасить по Граму (прил. 1).

БГКП являются грамотрицательными палочками.

Результаты определения количества колиформных бактерий

записать следующим образом: «БГКП обнаружены в 1 мл» или «БГКП в 1 мл не обнаружены» [10, 13].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатель микробиологической чистоты семенных дрожжей. Количество нежизнеспособных дрожжевых клеток в семенных дрожжах. Показатель содержания гликогена в семенных дрожжах. Общее количество микроорганизмов в пиве. Количество бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пиве.

13

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализов занести в тетрадь.

Сравнить полученные показатели с нормативами, приведенными в краткой теории к занятию.

Сделать выводы о качестве дрожжей и пива и записать их в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Как провести отбор проб от жидких и пастообразных продуктов?

2.Как провести отбор проб жидкостей из емкостей, оснащенных краном?

3.Когда необходимо провести анализ отобранной пробы?

4.Как и сколько времени можно хранить отобранные пробы?

5.Как провести отбор проб семенных дрожжей?

6.Как вскрыть упаковку с пробой пива?

7.Как отобрать навески и приготовить десятикратное разведение пива?

8.Каковы требования к микробиологической чистоте семенных дрожжей?

9.Как определить микробиологическую чистоту семенных дрожжей?

10.Каковы требования к количеству нежизнеспособных дрожжевых клеток в семенных дрожжах?

11.Как определить количество нежизнеспособных клеток семенных дрожжей?

12.Каковы требования к содержанию гликогена в клетках семенных дрожжей?

13.Как определить содержание гликогена в клетках семенных дрожжей?

14.Как определить общее число микроорганизмов в пиве?

15.Как выявить наличие бактерий группы кишечных палочек в пиве?

16.Каковы требования ИК 10-04-06-140-87 к общему количеству микроорганизмов в 1 мл пива?

17.Каковы требования ИК 10-04-06-140-87 к наличию бактерий группы кишечных палочек в 1 мл пива?

14

Лабораторная работа № 2 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОЛОКА

Молоко, представляющее собой один из наиболее полноценных продуктов питания, в то же время является хорошей питательной средой для развития и размножения микроорганизмов. Основными источниками попадания микроорганизмов в молоко являются вымя и кожный покров животного, руки доилыцика, посуда, воздух и др. В процессе хранения молока микроорганизмы изменяют его свойства. Для более длительного сохранения первоначальных свойств молока необходимо снижать до минимума возможности попадания в него микроорганизмов в процессе хранения и транспортирования.

При исследовании необходимо обращать внимание на количественный и качественный состав микробиоты молока. Это дает возможность правильно вести борьбу с возбудителями порчи молока.

В молоко при нарушении санитарных требований производства могут попасть бактерии кишечной группы, маслянокислые, гнилостные (аэробы и анаэробы), дрожжи и плесневые грибы, которые вызывают различные пороки молока и молочных продуктов.

Микробиологические анализы продукта проводят не более чем через 4 ч с момента отбора проб. Пробы должны храниться и транспортироваться до начала исследования в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше 6 ° С, не допуская подмораживания [12].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа сырого и пастеризованного молока.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; резиновые груши; весы электронные; ножи; металлические шпатели; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

15

Пипетка вместимостью 10 мл; пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло.

Растворы: карболового генцианвиолета; раствор Люголя; раствор водного фуксина; физиологический раствор для приготовления препарата в капельницах. Рабочий раствор метиленового синего (5 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего и 195 мл дистиллированной воды). 70 %-ный раствор этанола в широкогорлой стеклянной банке с крышкой вместимостью 100 мл.

Сырое молоко в пластиковой бутылке или стеклянной банке; пастеризованное молоко в пластиковой бутылке.

Дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри.

Пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; флаконы с 90 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Пробку бутылки или крышку банка с молоком протереть тампоном, смоченным 70 %-ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

Непосредственно перед вскрытием молоко в бутылке или банке перемешать 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания продукта.

16

Приготовление разведений

Приготовить разведение продукта от 10-2 до 10-5 в растворе хлористого натрия (прил. 2).

Оценка качества сырого молока методом определения редуктазы с метиленовым голубым

Метод основан на восстановлении метиленового синего окисли- тельно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Проведение анализа

В пробирки стерильными пипетками налить по 1 мл рабочего раствора метиленового синего и по 20 мл исследуемого сырого молока, закрыть резиновыми пробками и смешать путем медленного трехкратного переворачивания пробирок.

Пробирки поместить в водяную баню, которую поставить в термостат с температурой (37±1) ° С.

Вода в водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. В течение всего времени инкубации поддерживать температуру воды равной 37±1 ° С. Для предотвращения влияния на реакцию света термостат с водяной баней, в которой находятся пробирки, должен быть закрыт. Момент погружения пробирок в водяную баню считать началом анализа.

Наблюдение за изменением окраски провести через 40 мин, 2,5 и 3,5 ч с начала проведения анализа.

Окончанием анализа считать момент обесцвечивания окраски молока. При этом остающийся небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху (шириной не более 1 см) или небольшую окрашенная часть внизу пробирки (шириной не более 1 см) в расчет не принимать. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывать.

17

Обработка результатов

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов, указанных в табл. 2.1 [12].

Определение количества мезофильных аэробных

ифакультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

1.При анализе сырого молока высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри: 1 мл из 10-4 разведения (0,0001 г) и 1 мл из 10-5 разведения (0,00001 г) продукта.

При анализе пастеризованного молока высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри по 1 мл из 10-4 разведения (0,0001 г) продукта.

2.Провести анализ и записать результаты (прил. 3).

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

1.1 мл из 10-2 разведения (0,01 г) пастеризованного молока внести пипеткой в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Провести анализ и записать результаты (прил. 4).

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка класса сырого молока путем определения редуктазы с метиленовым голубым, количество мезофильных аэробных и факульта- тивно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в сыром или пастеризованном молоке, бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пастеризованном молоке.

18

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализа (класс сырого молока, содер-

жание КМАФАнМ в сыром или пастеризованном молоке, БГКП в пастеризованном молоке) занести в тетрадь.

Сравнить полученные показатели с требованиями Санитарноэпидемиологических правил и нормативов (СанПиН) 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (табл. 2.2) [1].

Таблица 2.2

Микробиологические показатели безопасности сырого и пастеризованного молока (СанПиН 2.3.2.1078-01) [1, 10]

Сделать вывод о качестве пищевого продукта и записать его в тетрадь.

19

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Каковы источники микроорганизмов, обнаруживаемых в молоке?

2.Какие микроорганизмы могут попасть в молоко при нарушении санитарных требований производства? Какую опасность представляет для производства?

3.Каковы требования к условиям хранения и срокам проведения анализов отобранных проб молока?

4.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой молока?

5.Как приготовить ряд последовательных десятикратных разведений исследуемого молока?

6.Как оценить класс сырого молока путем определения редуктазы с метиленовым голубым?

7.Как определить количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов в сыром или пастеризованном молоке?

8.Как выявить бактерии группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в пастеризованном молоке?

9.Каковы требования СанПиН 2.3.2.1078-01 к микробиологическим показателям безопасности сырого и пастеризованного молока?

Лабораторная работа № 3 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Втехнологии изготовлении кисломолочных продуктов используют специфическую микробиоту, которая в результате своей жизнедеятельности формирует вкус, запах и консистенцию готового продукта.

Йогурт представляет собой кисломолочный продукт с повышенным содержанием сухих веществ (16 %), что достигается выпариванием определенного количества влаги или добавлением сухого обезжиренного молока.

Всостав закваски для йогурта входят два вида молочнокислых бактерий: болгарская палочка (Lactobacillus delbruekii subsp. bulguricus) и термофильный стрептококк (Streptococcus salivarius subsp. thermophilus). Соотношение между видами (кокки: палочки) в йогурте должно составлять 1: 1.

20