Специальная микробиология. Лабораторный практикум

13. Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой.

В свежеприготовленном масле обнаруживаются молочнокислые стрептококки. В старом масле, кроме того, много дрожжей, палочек и гиф плесневых грибов.

Изучение постоянного препарата микроорганизмов сливочного масла

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х). Просмотреть несколько полей зрения. Обратить внимание на форму клеток и их расположение относительно друг друга.

2.Записать название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать клетки молочнокислых бактерий.

3.Найти на препарате и обозначить на рисунке молочнокислые стрептококки и другие микроорганизмы, если они есть в поле зрения.

4.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Первый этап

1.Внести пипеткой параллельно в две чашки Петри по 1 мл из 10- 4 разведения (0,0001 г) продукта.

2.Провести анализ и записать результаты (см. прил. 3).

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

1.1 мл из 10-2 разведения (0,01 г) продукта внести пипеткой в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Провести анализ и записать результаты (см. прил. 4).

Определение дрожжей и плесневых грибов

1.По 1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри.

2.Провести анализ и записать результаты (см. прил. 5).

31

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Постоянный препарат микроорганизмов сливочного масла, количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), бактерий группы кишечных палочек (БГКП), дрожжей и плесневых грибов в сливочном масле.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализа (содержание КМАФАнМ,

БГКП, дрожжей и плесеней) занести в тетрадь.

Сравнить полученные показатели с требованиями Санитарноэпидемиологических правил и нормативов (СанПиН) 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (табл. 4.1) [2].

Таблица 4.1

Микробиологические показатели безопасности сливочного масла

(СанПиН 2.3.2.1078-01) [2, 10]

32

Сделать вывод о качестве пищевого продукта и записать его в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Что представляет собой сливочное масло?

2.Что такое сладкосливочное масло?

3.Что такое кислосливочное масло? Какие микроорганизмы оно содержит?

4.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой сливочного масла?

5.Как приготовить ряд последовательных десятикратных разведений исследуемого сливочного масла?

6.Как приготовить постоянный препарат исследуемого сливочного масла?

7.Как определить количество мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов в сливочном масле?

8.Как выявить бактерии группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в сливочном масле?

9.Как определить наличие дрожжей и плесневых грибов в сливочном масле?

10.Каковы требования СанПиН 2.3.2.1078-01 к микробиологическим показателям безопасности сливочного масла?

Лабораторная работа № 5 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОЛБАСЫ

Сырокопченые колбасы характеризуются довольно высокой устойчивостью при хранении, что связано с низким значением активности воды (аω), повышенным содержанием соли, антисептическим действием веществ коптильного дыма.

После набивки фарша в оболочки колбасные батоны выдерживают для созревания фарша в течение 5–7 сут. при температуре 2–4 °С, сушат в течение 1,5 мес., коптят при температуре 18–22 °С в течение

2–5 сут.

В процессе получения сырокопченой колбасы участвует значительное количество микроорганизмов. Они частично помогают обеспечить стойкость колбасы при хранении, придать ей специфические органолептические свойства. Эту функцию выполняют полезная и желательная микробиота сырокопченой колбасы.

33

Во время осадки, созревания и сушки общая микробная обсемененность фарша существенно возрастает, при этом изменения претерпевает и качественный состав микробиоты.

В исходном фарше основную массу микроорганизмов составляют грамотрицательные палочки родов Pseudomonas, Proteus, Escherichia, Enterobacter, Aeromonas, грамоположительные бактерии родов

Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Pediococcus.

Через 10–30 сут. доминирующей микробиотой фарша становятся микрококки и молочнокислые бактерии видов L. plantarum, L. brevis,

Pediococcus cerevisiae.

Количество кислотообразующих микроорганизмов в этот период может составлять от 108 до 109 в 1 г.

Развиваясь при созревании и сушке, молочнокислые бактерии снижают рН среды до значений 5,5 и ниже, при которых задерживается рост нежелательной гнилостной микрофлоры и подавляется развитие патогенных микроорганизмов, синтезируют антибиотические вещества, называемые бактериоцинами, подавляющие размножение кишечных палочек, протеев, бацилл и клостридий, оказывают благоприятное влияние на консистенцию и связанность колбасного фарша. Это объясняется изменением поверхностного натяжения фарша в результате воздействия на растворимые белки мяса молочной кислоты, накапливающейся к концу ферментации, способствуют образованию

исохранению цвета некоторых колбасных изделий.

Внекоторых сырокопченых колбасах (сервелат, салями), кроме указанных групп бактерий, в созревании участвуют дрожжи родов

Debaryomyces и Candida. Дрожжи рода Debaryomyces проявляют ан-

тагонизм в отношении мицелиальных грибов.

С целью осуществления направленного процесса созревания сырокопченых колбас разработаны сухие бактериальные препараты (стартовые культуры), включающие различные микроорганизмы: молочнокислые бактерии (L. plantarum), микрококки (Micrococcus caseolyticus), педиококки (P. cerevisiae), стафилококки (S. xylosus).

34

В процессе копчения погибают, в основном, неспорообразующие бактерии. Бациллы, клостридии и мицелиальные грибы довольно устойчивы к коптильным веществам дыма [9].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа сырокопченой колбасы.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; резиновые груши; весы электронные; ножи; ножницы; металлические шпатели; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные: фарфоровая ступка диаметром 10 см; фарфоровый пестик; пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри; глазная пипетка.

Растворы: спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; раствор карболового генцианвиолета в капельнице; раствор Люголя в капельнице; водный раствор фуксина в капельнице; 96 %-ный этанол в капельнице; физиологический раствор в капельнице для приготовления препарата; 0,5 %-ный раствор соляной кислоты в капельнице; 5 %- ный раствор серной кислоты в капельнице; карболовый фуксин Циля в капельнице; раствор метиленового синего по Леффлеру в капельнице; 3 %-ный раствор пероксида водорода; дистиллированная вода для промывания препарата.

Сырокопченая колбаса; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке вместимостью 100 мл; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленной и охлажденной до 50±0,5 ° С агаризованной железосульфитной средой; среда Эндо в чашке Петри; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С голодным агаром; пробирки с 10–12 мл железосульфитной среды.

35

Пробирки с 9 мл стерильного пептонно-солевого раствора; флаконы с 90 мл стерильного пептонно-солевого раствора; пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Упаковку с продуктом протереть тампоном, смоченным 70 %- ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

В непосредственной близости от пламени спиртовки стерильными инструментами (смоченными 70 %-ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки) вскрыть упаковку [10, 13].

Отбор навески

Продукт в раскрытой упаковке тщательно измельчить стерильными (смоченными 70 %-ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки) ножницами, тщательно перемешать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) металлическим шпателем.

Продукт отобрать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) металлическим шпателем или пинцетом, перенести в предварительно взвешенную стерильную фарфоровую ступку и взвесить 10±0,1 г [10, 13].

Приготовление разведений

Приготовить разведение продукта до 10-2 в пептонно-солевом растворе (см. прил. 2).

Приготовление постоянного препарата микроорганизмов колбасы

1. Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки,

36

провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Тонкий кусочек колбасы сдавить между двумя предметными стеклами, не сдвигая в стороны так, чтобы на них остались отпечатки, затем стекла разнять.

3.Сверху на отпечаток налить спиртоэфирную смесь и оставить

еена 3 мин для фиксации препарата, затем препарат промыть струей дистиллированной воды.

4.Сверху на препарат положить полоску фильтровальной бумаги.

5.На фильтровальную бумагу налить раствор метиленового синего 1:40 и окрашивать 3 мин.

6.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промыть струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

7.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой.

Изучение постоянного препарата микроорганизмов колбасы

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х). Просмотреть несколько полей зрения. Обратить внимание на форму клеток и их расположение относительно друг друга.

2.Записать название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать клетки бактерий.

3.Найти на препарате и обозначить на рисунке бактерии и другие микроорганизмы, если они есть в поле зрения.

4.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП) Первый этап

1.1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта внести пипеткой в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Провести анализ и записать результаты (см. прил. 4).

37

Выявление сульфитредуцирующих клостридий Первый этап

1.1 мл из 10-2 разведения (0,01 г) продукта внести пипеткой в пробирку с 10–12 мл железосульфитной среды.

2.Посевы инкубировать в термостате при температуре (37±1) ° С не более 72 ч.

Второй этап

1.Просмотреть посевы, отметить положительные посевы. Положительными считать посевы в пробирках с признаками роста – отдельными черными колониями или полностью почерневшей питательной средой на глубине свыше 1 см.

2.Из отобранных пробирок бактериологической петлей сделать пересевы на поверхность железосульфитной среды в чашке Петри. После пересева в чашки Петри для образования второго слоя влить еще 10 мл голодного агара.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (37±1) ° С

втечение 24–48 ч.

Третий этап

Для подтверждения принадлежности выросших колоний сульфитредуцирующих микроорганизмов к роду Clostridium:

1.Приготовить мазок, окрасить его по Граму (см. прил. 1) и промикроскопировать препарат.

Сульфитредуцируюшне клостридии представляют собой грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно, в виде цепочек или скоплений параллельных клеток.

2.Приготовить мазок, окрасить бактериальные споры и промикроскопировать препарат.

Для этого приготовить толстый мазок на краю стекла, высушить его на воздухе, но не фиксировать. На мазок налить несколько капель 0,5 %-ного раствора соляной кислоты и, держа стекло пинцетом, подогревать 1–2 мин над пламенем спиртовки до закипания, после чего

38

остатки кислоты слить в кристаллизатор. Остывший препарат промыть водой, подсушить и зафиксировать на пламени спиртовки. На мазок налить карболовый фуксин Циля и подогревать стекло над пламенем спиртовки до появления паров. Слить краситель в кристаллизатор, налить на мазок 5 %-ный раствор серной кислоты и оставить на несколько секунд. Промыть препарат дистиллированной водой. Остатки воды слить в кристаллизатор, положить на стекло полоску фильтровальной бумаги, налить раствор метиленового синего по Леффлеру [11].

Бактериальные споры окрашиваются в рубиново-красный зеленый, вегетативные клетки – в синий цвет.

При спорообразовании споры сульфитредуцирующих клостридий овальные или сферические, субтерминальные или терминальные.

3.Определить отсутствие каталазы в культурах выросших микроорганизмов: на предметное стекло нанести каплю 3 %-ного раствора пероксида водорода, бактериологической петлей внести в каплю пероксида водорода исследуемую культуру микроорганизмов и тщательно перемешать. Если в смеси начинают выделяться пузырьки газа, то исследуемая культура образует каталазу.

Сульфитредуцирующие клостридии каталазу не образуют.

4.Подтвердить отсутствие роста в аэробных условиях: бактериологической петлей сделать пересевы на поверхность железосульфитной среды в чашке Петри. Посевы инкубировать в термостате при температуре (37±1) ° С в течение 18–72 ч.

Сульфитредуцирующие клостридии не растут в аэробных условиях.

Оценка результатов

Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств обнаружены сульфитредуцирующие грамположительные, каталазоотрицательные, не способные расти в аэробных условиях микроорганизмы, то дают заключение о том, что эти микроорганизмы относятся к сульфитредуцирующим клостридиям.

39

Результаты выявления сульфитредуцирующих клостридий записать следующим образом:

«Сульфитредуцирующие клостридии обнаружены в … ( указывается исследуемая масса продукта в г)» или «Сульфитредуцирующие клостридии в … ( указывается исследуемая масса продукта в г) не обнаружены» [7].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Наличие или отсутствие бактерий группы кишечных палочек и сульфитредуцирующих клостридий в колбасе.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализа (наличие или отсутствие бак-

терий группы кишечных палочек и сульфитредуцирующих клостридий в колбасе) занести в тетрадь.

Сравнить полученные показатели с требованиями Санитарноэпидемиологических правил и нормативов (СанПиН) 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (табл. 5.1) [2].

40