Специальная микробиология. Лабораторный практикум

Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на чистоту. Стерильным смоченным тампоном делают смыв с поверхности спецодежды или вырезают кусочки ткани. Смыв с клеенчатых передников дает довольно точное определение количества микроорганизмов; смыв с тканей, впитывающих влагу, дает лишь приблизительное представление о чистоте спецодежды. Чистоту спецодежды оценивают по наличию или отсутствию кишечной палочки. Кишечная палочка на чистой спецодежде должна отсутствовать.

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа смывов с поверхности столов и стен, рук и спецодежды.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; лупа; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; стеклянный стаканчик; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные: пробирки с 10 мл водопроводной воды или физиологического раствора; пробирки с 9 мл водопроводной воды или физиологического раствора; пробирки с 9,0 мл среды Кесслера с поплавками; пипетки на 1 мл; чашки Петри; ватные тампоны, завернутые в бумагу; пинцеты; металлические трафареты 10 х10 см.

Спирто-эфирная смесь; иммерсионное масло; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке вместимостью 100 мл; раствор кар-

71

болового генцианвиолета в капельнице; раствор Люголя в капельнице; раствор водного фуксина в капельнице; 96 %-ный этиловый спирт

вкапельнице; физиологический раствор для приготовления препарата

вкапельнице; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри, среда Гисса с глюкозой в пробирке; реактивы для определения оксидазной активности бактерий; фильтровальная бумага.

Спички; хлопчатобумажная ткань (или вата) для протирания микроскопа; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги); вата.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Отбор проб с поверхности стены

1.Смочить трафарет 70 %-ным этиловым спиртом и обжечь в пламени горелки.

2.Наложить трафарет на исследуемый объект.

3.Обожженным пинцетом взять ватный тампон, слегка смочить его в пробирке с 10 мл физиологического раствора и тщательно обмыть им ограниченную трафаретом площадь.

4.Тампон поместить в пробирку, физиологический раствор которой использовался для смачивания тампона.

5.Затем эту же площадь обтереть сухим тампоном и поместить его в ту же колбу.

6.Содержимое пробирки взболтать в течение 5 мин, чтобы смыть микроорганизмы с ваты.

Отбор проб с поверхности рук

1.Обожженным пинцетом взять ватный тампон, слегка смочить его в пробирке с 10 мл водопроводной воды или физиологического раствора.

2.Увлажненный тампон дать в руки обследуемому человеку и предложить протереть им сначала кожу левой, а затем правой руки в

72

такой последовательности: тыл кисти, ладонную поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа.

3. Тампон поместить в пробирку, водопроводная вода или физиологический раствор которой использовался для смачивания тампона.

5.Затем руки в той же последовательности обтереть сухим тампоном и поместить его в ту же колбу.

6.Содержимое пробирки взболтать в течение 5 мин, чтобы смыть микроорганизмы с ваты.

Записать в тетрадь:

–точное название объекта, с которого отбирают пробу;

–дату отбора пробы.

Определение общего количества микроорганизмов Первый этап

1.Сделать десятикратное разведение исследуемого смыва, т.е. взять пипеткой 1 мл исследуемого смыва и перенести его в пробирку

с9 мл водопроводной воды или физиологического раствора, не касаясь пипеткой поверхности раствора. Разведение перемешать другой стерильной пипеткой путем десятикратного заполнения и выталкивания смеси.

2.Стерильные чашки Петри разложить на столе и подписать на крышках фамилию студента, группу, дату посева.

3.Стерильной пипеткой отобрать 1 мл десятикратного разведения смыва и внести в стерильные чашки, слегка приоткрывая крышку.

4.После внесения разведения смыва в чашку Петри, залить его расплавленным и охлажденным до температуры 45±1 ° С питательным агаром при фламбировании краев колбы, где он содержится.

5.Разведение смыва быстро смешать с агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, не залитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставить на горизонтальной поверхности до застывания среды.

73

6. После застывания агара чашки с посевами поместить в термостат вверх дном не более чем по 3–4 чашки вместе. Посевы инкубировать 24 ч при (37±0,5) ° С и 24 ч при комнатной температуре.

Второй этап

Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитать при помощи лупы с увеличением в 2–5 раз. Для большей точности счета каждую подсчитанную колонию отметить со стороны дна тушью или чернилами для стекла.

1. При анализе санитарного состояния поверхности стола, стены или спецодежды результат подсчета колоний выразить в количестве бактерий на 1 см2 исследуемой поверхности. Необходимо выполнить следующее.

Устанавить количество микроорганизмов в 1 мл исходного разведения смыва. Для этого подсчитать число колоний на агаре в чашке и полученную величину умножить на степень разведения смыва.

Определить количество микроорганизмов в 10 мл смыва, соответствующее общему числу микроорганизмов, находящихся на той площади, с которой производился смыв. Для вычисления необходимо величину, соответствующую количеству микроорганизмов в 1 мл смыва, умножить на 10.

Определить количество микроорганизмов в 1 см2 исследуемой поверхности. Для расчета величину, характеризующую количество микроорганизмов в 1 мл смыва, делят на число квадратных сантиметров, с которых сделан смыв.

Санитарное состояние исследуемой поверхности оценивают по таблице 10.

2. При анализе санитарного состояния рук результат подсчета колоний выразить в количестве бактерий в 1 мл исходного разведения смыва. Для этого подсчитать число колоний на агаре в чашке и полученную величину умножить на степень разведения смыва.

Санитарное состояние рук оценить по табл. 9.2.

74

Определение наличия бактерий группы кишечных палочек Первый этап

1.Засеять 1,0 мл смыва в пробирку с 9,0 мл среды Кесслера с поплавком.

2.Посевы инкубировать 24 ч при (37±0,5) ° С.

Второй этап

1.Отсутствие помутнения и газа в пробирке позволяет получить отрицательный результат на наличие бактерий группы кишечных палочек в исследованном смыве и закончить изучение через 24 ч.

2.Если в пробирке отмечено помутнение и газ или помутнение, то сделать посев петлей штрихами на поверхность среды Эндо в чашке Петри.

3.Чашку поместить крышкой вниз в термостат и инкубировать

16–18 ч при (37±0,5) ° С.

Третий этап

1.При отсутствии роста колоний на среде Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых н других не характерных для кишечных палочек колоний получить отрицательный результат.

2.Если на среде Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтвердить микроскопированием (после окраски по Граму) (см. прил. 1) и постановкой оксидазного теста.

Постановка оксидазного теста. По 2–3 изолированных колонии каждого типа, выросших на среде Эндо, снять петлей или стеклянной палочкой и нанести штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом. В месте нанесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин, если бактерии имеют активную оксидазу.

75

3.Наличие грамотрицательных палочек в мазках и отрицательный оксидазный тест позволяют дать положительный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды.

4.При росте оксидазоотрицательных не окрашивающихся по Граму палочек две– три изолированные колонии разного типа засеить

вполужидкую среду Гисса с глюкозой и инкубировать 4–5 ч при (37±0,5) ° С. Анализ во всех этих случаях закончить через 40–42 ч.

Четвертый этап

1.При наличии кислоты и газа получить положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получить отрицательный результат, анализ заканчить через 44–48 ч.

2.При наличии только кислоты пробирки оставить на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получить окончательный отрицательный результат, при наличии газа

–положительный результат.

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество микроорганизмов, наличие бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в смывах.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализа (общее количество микроор-

ганизмов, наличие БГКП) занести в тетрадь.

76

Руководствуясь нормативами по оценке санитарного состояния стен и рук, приведенными в краткой теории к занятию, сделать вывод о санитарном состоянии исследуемого объекта и записать его в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Какие показатели определяют при контроле санитарного состояния производства: оборудования, трубопроводов, шлангов, инвентаря, тары, производственных помещений, рук и спецодежды обслуживающего персонала?

2.Как провести отбор проб для исследования санитарного состояния оборудования?

3.Каковы нормативы оценки санитарного состояния оборудования?

4.Как провести отбор проб для исследования санитарного состояния трубопроводов и шлангов?

5.Каковы нормативы оценки санитарного состояния трубопроводов и шлангов?

6.Как провести отбор проб для исследования санитарного состояния инвентаря и тары?

7.Каковы нормативы оценки санитарного состояния инвентаря и тары?

8.Как провести отбор проб для исследования санитарного состояния производственных помещений?

9.Каковы нормативы оценки санитарного состояния производственных помещений?

10.Как провести отбор проб для исследования санитарного состояния рук и одежды обслуживающего персонала?

11.Каковы нормативы оценки санитарного состояния рук и одежды обслуживающего персонала?

12.Как определить общее количество микроорганизмов в исследуемом смыве?

13.Как определить наличие бактерий группы кишечных палочек в исследуемом смыве?

14.Каковы нормативы для оценки санитарного состояния стен?

15.Каковы нормативы для оценки санитарного состояния рук?

77

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1.Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. – Сан-

ПиН 2.3.2.1078-01. – М.: РИТ ЭКСПРЕСС, 2002. – 216 с.

2.Инструкция санитарно-микробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства: ИК 10-04-06-140-87. – М.: Госагропром

СССР, 1988. – 55 с.

3.ГОСТ 10444.11-89. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. – М.: Изд-во стандартов, 2002. – 14 с.

4.ГОСТ 10444.12-88. Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов. – М.: Изд-во стандартов, 2008. – 6 с.

5.ГОСТ 10444.15-94. Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. – М.: Изд-во стандартов, 2003. – 4 с.

6.ГОСТ 29184-91. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae. – М.: Стандартинформ, 2010. – 7 с.

7.ГОСТ 29185-91. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества сульфитредуцирующих клостридий. – М.: Стандартинформ, 2006. – 6 с.

8.Кирова К.А., Слюсаренко Т.П. Руководство к практическим занятиям по микробиологии пищевых продуктов. – М.: Пищепромиздат, 1961. – 322 с.

9.Красникова Л.В. Микробиология: учеб. пособие. – СПб. : Троицкий мост, 2012. – 293 с.

10.Руденко Е.Ю. Общая биология и микробиология: лабор. практ. – Самара: Самар. гос. техн. ун-т, 2014. – 174 с.

11.Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: учеб. пособие / Под ред. А. Лабинской, Л. Блинковой, А.С. Ещиной. – М.: Медицина, 2004. – 576 с.

12.Панкратов А.Я., Григоров В.С., Кащенко Р.К. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. – М.: Пищевая промышленность, 1975. – 216 с.

13.Руденко Е.Ю. Пищевая микробиология: лабор. практ. – Самара: Самар.

гос. техн. ун-т, 2014. – 52 с.

78

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

ОКРАШИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО МЕТОДУ ГРАМА [10] Приготовление мазка

1.Подготовить предметное стекло: взять предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью.

2.Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

3.На подготовленное предметное стекло с помощью капельницы нанести маленькую каплю физиологического раствора.

4.Зажечь спиртовку.

5.Пробирку с культурой микроорганизмов поместить на внешнюю сторону ладони левой руки между большим и указательным пальцами таким образом, чтобы хорошо была видна вся поверхность питательной среды с выросшими на ней микроорганизмами. Горлышко пробирки придерживать всеми пальцами, кроме мизинца.

6.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

7.Не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать ватную пробку к ладони, достать ее из пробирки и держать так во время последующих манипуляций.

8.Края открытой пробирки с культурой обжечь в пламени спиртовки и после этого ввести в пробирку стерильную петлю.

9.Остудить петлю, прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки.

10.Взяв небольшое количество микробной массы с поверхности питательной среды, достать петлю из пробирки, следя за тем, чтобы переносимый материал не касался стенок или краев пробирки.

11.Края открытой пробирки с культурой обжечь в пламени спиртовки.

12.Края открытой пробирки с культурой и внутренний конец ватной пробки обжечь в пламени спиртовки и закрыть пробирку.

13.Закрытую пробирку с культурой поместить в штатив.

14.В каплю физиологического раствора на предметном стекле перенести культуру микроорганизмов, находящуюся на бактериологической петле.

15.Петлей размешать культуру микроорганизмов в капле физиологическо-

го раствора на предметном стекле до образования однородной клеточной суспензии. Эту процедуру следует проводить как можно более осторожно, избегая разбрызгивания жидкости.

79

16.Получившуюся суспензию равномерно размазать петлей на площади 1– 2 см2 как можно более тонким слоем, не затрагивая краев предметного стекла.

17.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя.

18.Поставить петлю в штатив.

19.Погасить спиртовку.

Высушивание мазка

Мазок высушить на воздухе.

Фиксация препарата

1.Зажечь спиртовку.

2.Взять предметное стекло пинцетом и трижды провести через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх, так, чтобы поверхность стекла, на которой расположен мазок, слегка запотевала.

3.Погасить спиртовку.

Окрашивание препарата

1.На мазок положить 2 полоски фильтровальной бумаги, налить раствор карболового генцианвиолета и окрашивать в течение 1 мин.

Предупреждение: для предотвращения выпадения красителей в осадок на всех этапах окраски следует избегать высыхания препарата, т.е. сливая один раствор, нужно незамедлительно наливать другой.

2.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, краситель слить и, не промывая препарат водой, налить на мазок раствор Люголя и как можно быстрее слить его.

3.Налить на мазок 96 %-ный этанол на 1–2 мин. Стекло слегка покачивать

испирт менять 3–4 раза.

4.Промыть препарат струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

5.Сверху на препарат положить полоску фильтровальной бумаги.

6.Налить раствор водного фуксина и окрашивать 3 мин.

7.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промыть струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

8.Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой.

При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют синефиолетовый цвет, грамотрицательные – розовый или красный цвет.

80