Специальная микробиология. Лабораторный практикум

Сквашивание молока проводится при температуре 40–45 °С в течение 3–4 ч. Кислотность йогурта не должна превышать 110 °Т. В 1 мл готового продукта содержание молочнокислых бактерий (МКБ) составляет 107–10 8 клеток.

Ряженка – это кисломолочный продукт, изготавливаемый из молока, подвергнутого высокотемпературной обработке с длительной выдержкой, за счет чего готовый продукт имеет кремовую окраску и характерный привкус. Ряженку вырабатывают из сырья повышенной жирности – от 3,2 до 6,0 %. Смесь для приготовления продукта нагревают до температуры 92–95 ° С и выдерживают в течение 2–3 ч. В процессе «топления» смесь перемешивают 2–3 раза для предотвращения образования пенок. После тепловой обработки молоко охлаждают до 43–45 °С и вносят 3–5 % закваски на основе

Streptococcus thermophilus.

Ряженку вырабатывают термостатным и резервуарным способами. Как показала практика, при использовании закваски на основе только термофильного стрептококка продукт часто получается пресным, с невыраженным вкусом. В связи с этим в состав закваски для ряженки вводит дополнительно болгарскую палочку в соотношении 1:4–1:5 к стрептококкам.

Содержание клеток МКБ в готовом продукте составляет 107– 108 КОЕ/мл. Кислотность готового продукта 80–90 °Т.

Варенец готовят из стерилизованною молока или молока, подвергнутого тепловой обработке при 95±2 ° С с выдержкой в течение 1 ч. В дальнейшем технология производства варенца аналогична технологии ряженки [8].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа кисломолочных продуктов.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бакте-

21

риологическая петля; пинцет; маркер; резиновые груши; весы электронные; ножи; ножницы; металлические шпатели; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Пипетка вместимостью 10 мл; пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло.

Ряженка, варенец или йогурт питьевой в бутылке или пластиковом пакете.

Растворы: карболового генцианвиолета; Люголя; водного фуксина; метиленового синего, физиологический раствор для приготовления препарата в капельницах. 70 %-ный раствор этанола в широкогорлой стеклянной банке с крышкой вместимостью 100 мл.

Дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С лактобакагаром; среда Эндо в чашке Петри; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С агаризированным солодовым суслом.

Пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; флаконы с 90 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Непосредственно перед вскрытием кисломолочный продукт перемешать 10-кратным переворачиванием с донышка на пробку или круговыми движениями.

Пробку бутылки или края пакета с кисломолочным продуктом протереть тампоном, смоченным 70%-ным этанолом, который уда-

22

лить путем свободного испарения. Край пакета надрезать профламбированными ножницами.

Приготовление разведений

Приготовить разведение продукта от 10-2 до 10-7 в растворе хлористого натрия (см. прил. 2).

Приготовление постоянного препарата микроорганизмов кисломолочного продукта

1.Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

4.Погрузить петлю в исследуемый кисломолочный продукт.

5.Перенести взятую каплю киломолочного продукта на предметное стекло и равномерно размазать петлей на площади 1–2 см2 как можно более тонким слоем, не затрагивая краев предметного стекла.

6.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя, и поместить в штатив.

7.Погасить спиртовку.

8.Мазок высушить на воздухе.

9.Зажечь спиртовку, зафиксировать мазок над пламенем и погасить спиртовку.

10.Сверху на препарат положить полоску фильтровальной бумаги.

11.На фильтровальную бумагу налить раствор метиленового синего 1:40 и окрашивать 3 мин.

12.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промыть струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

23

13. Препарат высушить на воздухе или осторожно промокнуть его фильтровальной бумагой.

Изучение постоянного препарата микроорганизмов кисломолочного продукта

1.Промикроскопировать препарат (объектив 100х, окуляр 10х). Просмотреть несколько полей зрения. Обратить внимание на форму клеток и их расположение относительно друг друга.

2.Записать название препарата, окраску и увеличение. Зарисовать клетки молочнокислых бактерий.

3.Найти на препарате и обозначить на рисунке молочнокислые палочки и молочнокислые кокки.

4.Препарат поместить в емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Определение количества молочнокислых микроорганизмов Первый этап

1.Высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри: 1 мл из 10-6 разведения (0,00001 г) и 1 мл из 10-7 разведения (0,000001 г) продукта.

2.Посевы залить расплавленным и охлажденным до температуры (45±1) ° С лактобакагаром.

3.Посевы инкубировать в термостате при температуре (33±1) ° С

втечение (72±3) ч.

Второй этап

1. Подсчитать количество колоний, выросших на чашках Петри. Для подсчета отобрать чашки Петри, на которых выросло от 15

до 300 колоний.

2. По результатам подсчета вычислить среднее арифметическое значение числа колоний из всех посевов одного разведения.

Если число колоний в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений соответствует требованиям, то вычислить среднее арифметическое количество микроорганизмов в каждом из этих отдельных разведений.

24

Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 pазa, то оценку провести по результатам посева наибольшего разведения.

Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний меньше 15 или больше 300, эти результаты использовать для подсчета среднеарифметического значения и при соответствии полученного значения интервалу от 15 до 300 его использовать для дальнейших расчетов.

3. Количество микроорганизмов в 1,0 г (мл) продукта вычисляют по формуле:

Результат вычисления выразить числом от 1,0 до 9,9 х 10n .

Результаты определения количества молочнокислых микроорганизмов записать следующим образом: «Молочнокилых микроорганизмов … ( число от 1,0 до 9,9 х 10n) КОЕ/г» [3].

Выявление бактерий группы кишечных палочек (БГКП)

1.1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта внести пипеткой в пробирку с 9 мл среды Кесслер.

2.Провести анализ и записать результаты (см. прил. 4).

Определение дрожжей и плесневых грибов

1.По 1 мл из 10-1 разведения (0,1 г) продукта высеять пипеткой параллельно в две чашки Петри.

2.Провести анализ и записать результаты (прил. 5).

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Постоянный препарат микроорганизмов кисломолочного продукта, количество молочнокилых микроорганизмов, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), дрожжей и плесневых грибов в кисломолочных продуктах.

25

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательные результаты анализа (содержание молочнокислых

микроорганизмов, БГКП, дрожжей и плесеней) занести в тетрадь. Сравнить полученные показатели с требованиями Санитарно-

эпидемиологических правил и нормативов (СанПиН) 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» (табл. 3.1) [9].

Таблица 3.1

Микробиологические показатели безопасности кисломолочных продуктов

(СанПиН 2.3.2.1078-01) [1, 6]

Сделать вывод о качестве пищевого продукта и записать его в тетрадь.

26

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Какой кисломолочный продукт называется йогуртом?

2.Какие микроорганизмы входят в состав йогурта?

3.Какой кисломолочный продукт называется ряженкой?

4.Какие микроорганизмы входят в состав ряженкой?

5.Какой кисломолочный продукт называется варенцом?

6.Какие микроорганизмы входят в состав варенца?

7.Как очистить и вскрыть упаковку с пробой кисломолочного продукта?

8.Как приготовить ряд последовательных десятикратных разведений исследуемого кисломолочного продукта?

9.Как приготовить постоянный препарат исследуемого кисломолочного продукта?

10.Как определить количество молочнокислых микроорганизмов в кисломолочном продукте?

11.Как выявить бактерии группы кишечных палочек (колиформных бактерий) в кисломолочном продукте?

12.Как определить наличие дрожжей и плесневых грибов в кисломолочном продукте?

13.Каковы требования СанПиН 2.3.2.1078-01 к микробиологическим показателям безопасности кисломолочных продуктов?

Лабораторная работа № 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЛИВОЧНОГО МАСЛА

Сливочное масло представляет собой концентрат молочного жира. Сладкосливочное масло вырабатывают без участия микроорганизмов, поэтому любое развитие в нем микробиологических процессов приводит к появлению пороков вкуса и запаха и, в конечном сче-

те, к порче продукта.

Кислосливочное масло изготавливают путем сквашивания сливок закваской, в состав которой входят мезофильные лактококки и лей-

коностоки: Lactococcus lactis ssp. lactis, Lac. laclis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris.

27

В результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий кислосливочное масло приобретает специфический кисломолочный вкус и приятный запах, обусловленные накоплением молочной кислоты и ароматических веществ (диацетила, ацетальлегида, летучих жирных кислот и др.).

Микробиота кислосливочного масла представлена, главным образом, молочнокислыми бактериями. Количество молочнокислых может составлять от 106 до 108 в 1 г, причем в масле с длительным сквашиванием сливок их значительно больше, чем в масле с кратким сквашиванием. Объем посторонней микробиоты незначителен, ее развитие ограничивается образующейся молочной кислотой [9].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа сливочного масла.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; центрифуга; кристаллизатор со стеклянным мостиком; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; ножницы; маркер; резиновые груши; весы электронные; ножи; металлические шпатели; емкость с дезинфицирующим раствором (6 %-ный раствор пероксида водорода).

Стерильные: пипетки вместимостью 1 мл; чашки Петри; колба вместимостью 250 мл, закрытая стерильной ватной пробкой. Центрифужные пробирки.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло.

Растворы: метиленового синего 1:40; карболового генцианвиолета; раствор Люголя; раствор водного фуксина; физиологический раствор для приготовления препарата в капельницах.

Сладкосливочное масло; кислосливочное масло; 70 %-ный этанол в широкогорлой стеклянной банке вместимостью 100 мл; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью

28

250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С агаризированным солодовым суслом.

Пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; флаконы с 90 мл стерильного 0,9 %-ного раствора хлористого натрия; пробирки с 9 мл среды Кесслер с поплавками (или комочками ваты).

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла, кусочек сухого мыла, хлопчатобумажная ткань для протирания стекол, полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Вскрытие упаковки

Негерметичную упаковку с маслом протереть тампоном, смоченным 70 %-ным этанолом, который удалить путем свободного испарения.

Вскрытие упаковки провести в непосредственной близости от пламени спиртовки стерильными инструментами (смоченными 70 %- ным этанолом, затем обожженными в пламени спиртовки) [10, 13].

Отбор навески

Масло разрезать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) ножом на несколько частей. Навеску массой около 10±0,1 г отобрать стерильным (смоченным 70 %-ным этанолом, затем обожженным в пламени спиртовки) ножом или скальпелем из разных мест (включая поверхностный слой), перенести в стерильную стеклянную колбу вместимостью 250 мл со стерильной пробкой и расплавлить на водяной бане, нагретой до 40–45 ° С и перемешивать до получения однородной эмульсии.

Приготовление разведений

Приготовить разведение продукта от 10-2 до 10-4 10-7 в растворе хлористого натрия (см. прил. 2).

29

Приготовление постоянного препарата микроорганизмов сливочного масла

Для приготовления мазков сливочное масло нагревают в центрифужных пробирках на водяной бане при температуре 70 ° С. Затем центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1500 об/мин.

Верхний слой масла и белки сливают, а из осадка готовят мазок.

1.Подготовить предметное стекло: взяв предметное стекло за короткие боковые грани большим и указательным пальцами левой руки, провести по нему кусочком мыла, увлажнить и протереть хлопчатобумажной тканью. Поместить стекло на стеклянный мостик над кристаллизатором.

2.Зажечь спиртовку.

3.В правую руку взять бактериологическую петлю так, как держат карандаш, и докрасна прокалить ее в пламени спиртовки, начиная с держателя.

4.Погрузить петлю в исследуемое сливочное масло.

5.Перенести взятое масло на предметное стекло и равномерно размазать петлей на площади 1–2 см2 как можно более тонким слоем, не затрагивая краев предметного стекла.

6.Бактериологическую петлю докрасна прокалить в пламени спиртовки, начиная с держателя, и поместить в штатив.

7.Погасить спиртовку.

8.Мазок высушить на воздухе.

9.Сверху на мазок налить спиртоэфирную смесь и оставить ее на 3 мин для фиксации препарата, затем препарат промыть струей дистиллированной воды.

10.Сверху на препарат положить полоску фильтровальной бумаги.

11.На фильтровальную бумагу налить раствор метиленового синего 1:40 и окрашивать 3 мин.

12.По истечении времени окрашивания фильтровальную бумагу снять пинцетом, препарат промыть струей дистиллированной воды до тех пор, пока стекающая вода станет бесцветной.

30