Специальная микробиология. Лабораторный практикум

шипнике. Диск (6) прикреплен к фланцу оси малой крылатки, на диск устанавливают чашку Петри (8) с плотной питательной средой. С помощью трех пружин (7) производят центрирование и фиксацию чашки. В крышку вложен прозрачный диск из плексигласа (11), имеющий клиновидную щель (12). В центре основания прибора (2) укрепляют штуцер с диафрагмой (14). Воздух, идущий через штуцер, проходит через выходную трубку (15), соединенную с микроманометром.

При вращении вентилятора воздух засасывается через щель крышки, ударяется о поверхность питательной среды. В результате удара находящиеся в воздухе аэрозоли, в том числе пылевые частицы и капли, содержащие микроорганизмы, прибиваются к поверхности плотной питательной среды. Вращение чашки гарантирует равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды, находящейся в чашке.

Рис. 8.1. Аппарат Кротова [3]:

1 – цилиндрический корпус; 2 – основание прибора; 3 – электромотор; 4 – центробежный вентилятор; 5 – восьмилопастная крыльчатка; 6 – диск; 7 – пружины; 8 – чашка Петри; 9 – крышка прибора;

10 – накидные замки; 11 – диски из плексигласа; 12 – клиновидная щель; 13 – разрезное кольцо; 14 – штуцер

с диафрагмой; 15 – выводная трубка

61

Аппарат Кротова прост в работе, эффективен для улавливания микрофлоры в пылевой фазе аэрозоля, дает четкие сопоставимые результаты, за короткое время позволяет произвести отбор проб воздуха непосредственно на чашки со средами. Основной недостаток прибора состоит в том, что он нуждается для работы в электроэнергии и это ограничивает его применение для исследования атмосферного воздуха [10, 13].

Седиментационный метод

Метод Коха основан на оседании микроорганизмов под действием силы тяжести на поверхности питательной среды открытой чашки Петри.

При посеве воздушной микрофлоры методом Коха чашку Петри с плотной питательной средой открывают и выставляют на горизонтальную поверхность на уровне дыхания сидящего или стоящего человека. Чашки с мясопептонным или питательным агаром экспонируют на воздухе от 5 до 15 мин, а с дифференциальнодиагностическими средами – от 30 мин до 1–3- х ч в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Затем чашку Петри с плотной питательной средой закрывают крышкой, переносят в термостат и инкубируют в условиях, благоприятных для развития выделяемых микроорганизмов.

При использовании метода Коха проводят количественный учет микроорганизмов воздухе по методу В. Л. Омелянского, который по-

лагал, что на поверхность 100 см2 питательной среды за 5 мин оседает такое количество клеток микроорганизмов, которое содержится в 10 л воздуха.

Учитывая общее число выросших колоний из клеток, осевших из воздуха на чашке со средой за 5 мин, можно рассчитать общее количество клеток в 1000 л воздуха по формуле

где Х – количество клеток микроорганизмов в 1000 л воздуха;

62

А – количество колоний, выросших в чашке; В – площадь чашки, см2 (табл. 8.1);

τ – время, в течение которого чашка была открыта, мин; 5 – время экспозиции для осаждения клеток, содержащихся в 10 л

воздуха, мин; 100 – число для пересчета площади чашки на 100 см2;

100 – число для пересчета 10 л воздуха в 1000 л.

Пример расчета. В чашке Петри диаметром 10 см2 при экспозиции 10 мин выросло 45 колоний микроорганизмов.

х= 45×100×5 ×100 =2866 КОЕ/1000 л. 78,5×10

Таким образом, в 1000 л воздуха находится 2866 клеток микроорганизмов.

Седиментационный метод не точен и абсолютно не пригоден для исследования атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его движения. Он может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют более совершенные приборы или электроэнергия [10, 13].

Цель работы – ознакомиться с методами микробиологического анализа воздуха; провести количественный учет бактерий в воздухе закрытых помещений седиментационным методом.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; лупа с 2–5- м кратным увеличением спиртовка;

63

маркер; стерильные чашки Петри, колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром. Спички.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Разливание стерильной питательной среды

встерильные чашки Петри

1.Развернуть стерильную чашки Петри.

2.Зажечь спиртовку.

3.Флакон с расплавленным и охлажденным до температуры 50±1 ° С питательным агаром взять в правую руку и держать в наклонном положении.

4.Мизинцем и безымянным пальцем левой руки прижать ватную пробку к ладони, достать ее из пробирки и держать так во время последующих манипуляций.

5.Края открытого флакона и внутренний конец ватной пробки обжечь в пламени спиртовки.

6.Приоткрыв большим и указательным пальцами левой руки крышку первой чашки Петри, быстро налить в чашку 15–20 мл расплавленного питательного агара, чтобы дно чашки было полностью покрыто.

7.Закрыть крышку чашки Петри и оставить ее на горизонтальной поверхности до тех пор, пока не застынет среда.

Проведение микробиологического исследования воздуха Первый этап

1.Чашку Петри с застывшей питательной средой перенести в исследуемое помещение и поставить ее на горизонтальную поверхность на расстоянии около 1,0–1,5 м от поверхности пола.

2.Открыть чашку 10 (точно фиксируя время экспозиции). Крышку одним концом положить на бумагу, в которую чашки были завернуты, а другим – на самый край бортика открытой чашки, стараясь не закрыть поверхности питательной среды.

64

3.Следить за тем, чтобы вблизи чашки не ходили и не разговаривали, так как это может повлиять на получение достаточно объективных данных.

4.Закрыть чашку чашки Петри, подписать фамилии студентов, номер группы и дату посева, завернуть чашку Петри в бумагу, и поместить в термостат (вверх дном) для выращивания колоний микроорганизмов.

5.Посевы инкубировать в термостате при температуре 28–30 ° С в течение 48 ч. Учитывая, что некоторые микроорганизмы развиваются медленно, окончательный подсчет выросших колоний провести на 5-е сутки.

Второй этап

1.Подсчитать количество выросших колоний микроорганизмов с помощью лупы.

2.Рассчитать общее количество микроорганизмов в 1000 л исследуемого воздуха по формуле, приведенной в краткой теории к за-

нятию [10, 13].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество микроорганизмов в воздухе.

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Окончательный результат расчета общего количество микроорга-

низмов в 1000 л исследуемого воздуха занести в отчет.

65

Руководствуясь нормативами по оценке бактериальной загрязненности воздуха, приведенными в краткой теории к занятию, сделать вывод о санитарном состоянии воздуха исследуемого объекта и записать его в тетрадь.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Какие микроорганизмы могут быть обнаружены в атмосферном воздухе и воздухе закрытых помещений?

2.Для чего изучают микрофлору воздуха? Какие группы микроорганизмов выявляют и в каких случаях?

3.Существует ли разница в методических подходах к изучению воздушной среды закрытых помещений и атмосферы? Ответ поясните.

4.Какие показатели определяют при санитарно-гигиенической оценке воздуха? Какие микробиологические методы исследования воздуха вы знаете?

5.Каков принцип действия аппарата Кротова, его достоинства и недостатки?

6.В чем сущность седиментационного метода изучения воздуха? Какие исследования можно провести при помощи данного метода? Каковы недостатки седиментационного метода посева воздушной микрофлоры?

7.Как провести посев воздушной микрофлоры седиментационным методом?

8.Как провести количественный учет микроорганизмов в воздухе?

9.Каковы нормативы оценки санитарного состояния воздуха по показателю бактериальной загрязненности?

Лабораторная работа № 9 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СМЫВОВ

Качество пищевых продуктов непосредственно зависит от санитарного режима на производстве. Нередко бывают случаи, когда неудовлетворительное санитарное состояние предприятий пищевой промышленности оказывается причиной выпуска недоброкачественной продукции, понижает выход готовой продукции, приводит к возникновению очагов инфекции, нарушающих нормальный ход технологического процесса.

Для контроля за санитарно-гигиеническим состоянием пищевого предприятия и установления путей распространения инфекции пери-

66

одически проводят изучение бактериальной загрязненности различных предметов окружающей обстановки, рук и одежды обслуживающего персонала.

При этом определяют общее количество микроорганизмов (обычно с пересчетом: на 1 см2 исследуемой поверхности) и наличие бактерий группы кишечной палочки (как показатель фекального загрязнения, свидетельствующий о нарушении санитарного режима).

Контроль санитарного состояния оборудования

Осуществляется после мойки, пропаривания и дезинфекции непосредственно перед началом работы.

Биологическое загрязнение оборудования устанавливают путем микроскопирования последней промывной воды. Для этой цели в стерильную пробирку отбирают 10 мл промывной воды и центрифугируют при 1500–2000 об/мин. в течение 10 мин. Затем центрифугат сливают, каплю осадка переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Вхорошо вымытом оборудовании количество микроорганизмов

впрепарате должно быть не более 1–2 и не в каждом поле зрения. В 10 полях зрения должно быть не более пяти– шести микроорганизмов. Наличие микроорганизмов в каждом поле зрения указывает на плохую мойку оборудования.

Отбор проб для исследования чистоты поверхности оборудования с достаточно открытой внутренней поверхностью можно производить с помощью металлического трафарета. Перед взятием проб трафарет (площадь 10, 25 или 100 см2) обжигают. Ограниченную трафаретом площадь соскабливают или протирают ватным тампоном (0,5 г), смоченным в 10 мл стерильной водопроводной воды или физиологического раствора. Тампон помещают в ту же пробирку, где он смачивался водой, хорошо встряхивают, после чего делают посевы на общее количество микроорганизмов и присутствие кишечной палочки.

Вхорошо вымытом оборудовании общее количество микроорганизмов не должно превышать количество микроорганизмов в воде, поступающей в производство. Наличие бактерий группы кишечной

67

палочки является показателем неудовлетворительного состояния оборудования независимо от общего количества микрофлоры в анализируемом объекте.

Контроль санитарного состояния трубопроводов и шлангов

При микробиологическом контроле трубопроводов, шлангов и аппаратуры, внутренняя поверхность которых непригодна для взятия пробы с помощью трафарета, исследование на чистоту ведут путем анализа промывных вод.

Для этого трубопровод или аппарат отделяют от остального оборудования, освобождают от воды или продуктов и пропускают через него чистую водопроводную воду. Посев на общее количество микроорганизмов и на присутствие кишечной палочки делают из воды, взятой перед пуском ее в исследуемый объект и по выходе из него.

Общее количество микроорганизмов и коли-титр исследуемой воды не должны отличаться от количества микроорганизмов и колититра воды, применяемой в производстве.

Контроль санитарного состояния инвентаря и тары Цеховой инвентарь. Для оценки мойки цехового инвентаря про-

бы отбирают в тот момент, когда инвентарь подготовлен к работе. Пробы на анализ берут следующим образом: смывы с мелкого

инвентаря (мешалки, пробники, термометры, ножи, шприцы и т. д.) берут стерильным тампоном со всей поверхности предмета и исследуют на общее количество микроорганизмов и на наличие бактерий группы кишечной палочки; смывы со столов, стеллажей, ящиков, лотков, ведер, лопат и т. д. берут стерильным тампоном при помощи обожженного трафарета и производят аналогичные анализы.

Шканты, пробки, кронен-пробки. Для анализа отбирают около

300–500 мл воды, в которой находились во время работы пропаренные пробки и шканты. Посев на общее количество микроорганизмов производят на сусло-агар. Наличие бактерий группы кишечной палочки определяют фильтрацией через мембранный фильтр. Общее

68

количество микроорганизмов и кишечных палочек должно быть такое же, как и в воде, поступающей в производство.

Кронен-пробки (10 шт.) отбирают обожженным пинцетом в стерильную чашку с 100 мл стерильной воды и в течение 5 мин сильно встряхивают. В воде определяют общее количество микроорганизмов и коли-титр.

Стеклянная тара (бутылки, банки и т. п.). Из бутыломоечной машины отбирают 5–10 вымытых бутылок, закрывают простерилизованными пробками и переносят в лабораторию. Здесь их тщательно ополаскивают 100 мл стерильной воды, переливая из одной бутылки

вдругую. Поворотом бутылки смачивают всю внутреннюю поверхность, причем держат их в горизонтальном положении, чтобы не попала инфекция из воздуха. После ополаскивания последней бутылки воду сливают в стерильный сосуд, откуда делают высев для определения общего количества микроорганизмов и коли-титра.

Общее количество микроорганизмов в пересчете на 1 бутылку должно быть не более 300, коли-титр не менее 100.

Бочки, бидоны, цистерны. Определение чистоты мойки производят микроскопированием осадка после центрифугирования пробы последней промывной воды. Загрязненность тары определяют путем высева стерильно отобранной промывной воды. Общее количество микроорганизмов в 1 мл и коли-титр не должны отличаться от общего количества микроорганизмов и коли-титра воды, применяющейся

впроизводстве.

Контроль санитарного состояния производственных помещений

Чистоту стен и пола производственных помещений контролируют путем микроскопирования препаратов, взятых следующим образом: соскабливают часть загрязненной поверхности стены или пола помещения, соскоб помещают в пробирку со стерильной водой и, хорошо взболтав, просматривают препарат под микроскопом без окраски и с окраской метиленовым синим с иммерсионным объективом.

69

Для количественного учета микроорганизмов пользуются трафаретом и стерильным ватным тампоном, делая высев в чашки Петри.

Санитарное состояние поверхности оценивают по табл. 9.1 [8].

Контроль санитарного состояния рук и одежды персонала

Чистоту рук контролируют путем посева смыва, взятого с рук обследуемого, для определения общего количества микроорганизмов и присутствия бактерий группы кишечной палочки.

Для этого ватные тампоны (0,5 г) или марлевые салфетки размером 5 х 5 см предварительно стерилизуют в отдельных бумажных пакетах. Захватывают тампон или салфетку обожженным пинцетом и смачивают в пробирке с 10 мл стерильной воды.

Увлажненный тампон или салфетку дают в руки обследуемому, предлагая протереть им сначала кожу левой, а затем правой руки в такой последовательности (от участков с меньшей к участкам с большей загрязненностью): тыл кисти, ладонную поверхность, межпальцевые пространства, ногтевые ложа.

По окончании процедуры салфетки или тампоны помещают в пробирку со стерильной водой, хорошо взбалтывают и делают посев для определения общего количества микроорганизмов и кишечной палочки (в количестве 1 мл на 10 мл бродильной среды).

На чистых руках кишечная палочка не обнаруживается. Ее присутствие указывает на недостаточную чистоплотность данного лица.

Санитарное состояние рук оценивают по табл. 9.2 [8].

70