Специальная микробиология. Лабораторный практикум

–цель исследования: сделан ли отбор пробы по особым показаниям или в порядке текущего санитарного надзора;

–фамилия специалиста, отбиравшего пробу.

Анализ пробы в лаборатории необходимо провести как можно быстрее от момента ее отбора: срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.

Доставку пробы воды осуществляют в продезинфицированных контейнерах-холодильниках при температуре 4– 10 ° С. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора. Анализ пробы не проводится, если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения [10].

Цель работы – освоить методы микробиологического анализа воды; провести микробиологический анализ воды из водопроводной сети централизованного водоснабжения.

АППАРАТУРА, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ

Термостат; микроскоп; лупа с 2–5- м кратным увеличением; фильтровальный аппарат; электрическая плитка; водяная баня; водяная баня с терморегулятором; кристаллизатор; стеклянный мостик; спиртовка; промывалка; штатив для пробирок; песочные часы; бактериологическая петля; пинцет; маркер.

Стерильные: бутылки для отбора проб вместимостью 500 мл с 2 мл 1,5 %-ного раствора тиосульфата натрия, закрытые ватными пробками, снабженные бумажными колпачками (хорошо подобранные притертые, каучуковые или корковые пробки, завернутые в бумагу, должны быть привязаны к горлышку флакона); пипетки вместимостью 1 мл, чашки Петри.

Спиртоэфирная смесь; иммерсионное масло; раствор карболового генцианвиолета в капельнице; раствор Люголя в капельнице; раствор водного фуксина в капельнице; 70 %-ный этанол в стеклянной банке с крышкой; физиологический раствор в капельнице для приготовле-

51

ния препарата; дистиллированная вода для промывания препарата; колба вместимостью 250 мл с расплавленным и охлажденным до 50±0,5 ° С питательным агаром; среда Эндо в чашке Петри; среда Гисса с глюкозой в пробирке; реактивы для определения оксидазной активности бактерий; фильтровальная бумага; мембранные фильтры.

Спички; хлопчатобумажная ткань или вата для очистки объектива микроскопа от остатков иммерсионного масла; набор для приготовления препаратов (предметные стекла; кусочек сухого мыла; хлопчатобумажная ткань для протирания стекол; полоски фильтровальной бумаги).

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Отбор пробы воды

1.Взять пинцетом ватный тапмон, смочить его 96 %-ным этанолом, поджечь и простерилизовать кран обжиганием пламенем.

2.Спустить воду в течение 10–15 мин при полностью открытом

кране.

3.Непосредственно перед отбором пробы снимают с флакона бумажный пакет или колпачок вместе с пробкой, не касаясь пробки руками.

4.Наполнить флакон с таким расчетом, чтобы при транспортировании не замочить пробку. Объем отбираемой пробы – 500 мл.

5.Закрыть наполненный флакон каучуковой или корковой пробкой и стерильным бумажным колпачком, обвязать колпачок ниткой или бечевкой.

Определение общего количества бактерий в воде Первый этап

1.Питательный агар расплавить на водяной бане и охладить до температуры (45±5) ° С.

2.Две стерильные чашки Петри разложить на столе и подписать фамилию студента, группу и дату посева.

52

3.С флаконов с пробой воды снять бумажные колпачки, вынуть пробки, горлышки профламбировать, после чего воду тщательно перемешать осторожным продуванием воздуха через стерильную пипетку.

4.Стерильной пипеткой отобрать 1 мл воды и внести в одну стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку. Стерильной пипеткой отобрать 1 мл воды и внести в другую стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.

5.После внесения воды в чашки Петри залить ее 10–12 мл расплавленного и охлажденного до 50±0,5 ° С питательного агара при фламбировании краев колбы, где он содержится.

6.Воду быстро смешать с агаром, осторожно вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, не залитых частей дна чашки, попадания среды на края и крышку чашки. После этого чашки оставить на горизонтальной поверхности до застывания среды.

7.После застывания агара чашки с посевами поместить в термостат вверх дном не более чем по 3–4 чашки вместе. Посевы выращивать в термостате при 37±0,5 ° С в течение 24±2 ч.

Второй этап

1. Колонии, выросшие на поверхности и в глубине агара, подсчитать при помощи лупы с увеличением в 2–5 раз.

Если в чашке выросло свыше 300 колоний, то допускается подсчитывать колонии при помощи лупы при сильном боковом освещении. Подсчитывают не менее 20 квадратов площадью 1 см2 каждый в разных местах чашки, затем выводят среднее арифметическое число колоний на 1 см2, величину которого умножают на площадь чашки в см2, вычисленную по формуле S = πr2.

2.Результат подсчета колоний выразить в количестве бактерий на 1 мл анализируемой воды (КОЕ/мл). Результаты округлить в соответствии с табл. 7.1.

3.Окончательный результат занести в отчет [10, 13].

53

Определение титра кишечной палочки методом мембранных фильтров

Первый этап

1.Мембранные фильтры, визуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей, и т. п., замочить в 70 %-ном этаноле в стеклянной банке с крышкой не менее чем на 30 мин, а затем использовать.

2.Взять пинцетом ватный тапмон, смочить его 96 %-ным этанолом, поджечь и простерилизовать фильтровальный аппарат обжиганием пламенем. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) фламбированным пинцетом положить стерильный мембранный фильтр, прижать его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепить устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

3.В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности налить и профильтровать 100 мл пробы воды.

4.После окончания фильтрования снять воронку, фильтр осторожно приподнять за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем перенести его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, и плотно прижать к среде, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

54

5.В воронку (стакан) фильтровального прибора при соблюдении правил стерильности налить и профильтровать 200 мл пробы воды.

6.После окончания фильтрования снять воронку, фильтр осторожно приподнять за край фламбированным пинцетом при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на нижней стороне фильтра, а затем перенести его, не переворачивая, на среду Эндо, разлитую в чашку Петри, и плотно прижать к среде, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.

На одну чашку можно поместить 3–4 фильтра с условием, чтобы фильтры не соприкасались.

7.Под каждым фильтром на дне чашки сделать надпись с указанием объема профильтрованной воды, даты посева и фамилий студентов.

8.Чашки с фильтрами на среде Эндо поместить в термостат дном вверх и инкубировать при 37±0,5 ° С в течение 18–24 ч.

Второй этап

1.При отсутствии роста колоний на фильтрах или при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получить отрицательный результат.

2.При наличии на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, розовых, прозрачных), из нескольких колоний каждого типа приготовить мазки, окрасить их по Граму (см. прил. 1) и промикроскопировать. При отсутствии в мазках грамотрицательных не спороносных палочек дать отрицательный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды.

При наличии в мазках грамотрицательных, коротких, полиморфных, не образующих спор палочек (возможны удлиненные нитевидные формы, а также крупные палочки, полярно окрашенные) выполнить оксидазный тест.

55

Постановка оксидазного теста. Мембранный фильтр с выросши-

ми на нем колониями бактерий перенести пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги несколько большего диаметра, чем фильтр, обильно смоченный реактивами для определения оксидазной активности бактерий. Через 2–4 мин определить результат.

Все посиневшие колонии или колонии с синим ободком имеют активную оксидазу; колонии, не изменившие цвета, оксидазной активностью не обладают.

3.При наличии на фильтрах только оксидазоположительных колоний дать отрицательный ответ о наличии бактерий группы кишечных палочек в анализируемом объеме воды.

Отсутствие оксидазы у темно-красных с металлическим блеском

ибез него (лактозоположительных) колоний позволяет отнести их к бактериям группы кишечных палочек.

4.При наличии на фильтратах розовых и бесцветных колоний с отрицательной оксидазной активностью подсчитать их и подтвердить принадлежность к бактериям группы кишечных палочек посевом 2–3 изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду Гисса с глюкозой.

Учитывая бактерицидность реактива для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции перенести обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее чем через 5 мин) пересеить оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду Гисса с глюкозой.

5.Посевы инкубировать в термостате при 37±0,5 ° С в течение 4–5 ч.

Третий этап

1.При наличии кислоты и газа получить положительный результат. При отсутствии кислоты и газа получить отрицательный результат.

2.При наличии только кислоты пробирки оставить на 24 ч для окончательного учета. При отсутствии газообразования через 24 ч получить окончательный отрицательный результат, при наличии газа

–положительный результат.

56

Вычисление коли-индекса. Результат выразить в виде колииндекса, т. е. количества бактерий группы кишечных палочек в 1 мл воды.

Коли-индекс высчитать следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножить на 1000 мл и разделить на анализируемый объем воды.

При отсутствии на фильтрах бактерий группы кишечных палочек коли-индекс будет меньше той величины, которая была бы определена в случае обнаружения в анализируемом объеме одной клетки кишечной палочки.

Пример 1. При посеве 300 мл воды не выросло ни одной колонии. (1х1000) : 300 = 3. Коли-индекс менее 3.

При наличии бактерий группы кишечных палочек вычисляют ко- ли-индекс, учитывая весь объем анализируемой воды.

Пример 2. При посеве трех объемов воды по 100 мл на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3x1000) : 300 = 10. При посеве 10 и 100 мл воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-нндекс равен (6х1000) : 110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Пример 3. В 100 мл – сплошной рост, в 10 мл – 12 бактерий группы кишечных палочек; коли-индекс равен (12x1000) : 10 = 1200 [10, 13].

ПОЛУЧАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Общее количество микроорганизмов и коли-индекс воды из водопроводной сети.

57

СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Лабораторная работа № _______

Название лабораторной работы

Цель работы – …

Ход выполнения лабораторной работы Перечислить аппаратуру, лабораторную посуду, материалы, ре-

активы. Подробно описать методику проведения работы.

Результаты работы Записать в отчет по лабораторной работе:

−точное месторасположение крана, из которого отбирают пробу;

−дату отбора пробы (с указанием года, месяца, числа и часа);

−время спуска воды из крана.

Окончательный результат анализа (величину коли-индекса) занести в отчет.

Сравнить полученный показатель с требования ГОСТа для питьевой воды. Питьевая вода удовлетворяет требованиям ГОСТ 2874-82, если коли-индекс не превышает 3 (коли-титр не ниже 300); общее количество микроорганизмов не более 100 в 1 мл.

Сделать вывод о качестве исследуемой воды и записать его.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Для чего изучают микробиоту воды? Какие группы микроорганизмов выявляют и в каких случаях?

2.Существует ли разница в методических подходах к изучению воды открытых водоемов и водопроводной сети? Ответ поясните.

3.Как провести отбор проб воды для микробиологического анализа?

4.Каким образом можно хранить и транспортировать отобранные пробы воды?

5.Каким образом можно определить общее количество микроорганизмов в воде? Каковы нормативы оценки санитарного состояния воды по показателю ее бактериальной загрязненности?

6.Каким методом можно определить количество бактерий группы кишечных палочек в воде? Каковы его достоинства и недостатки? Какие микробиоло-

58

гические показатели характеризуют интенсивность фекального загрязнения воды?

7.Как провести определение титра бактерий группы кишечных палочек в воде методом мембранных фильтров?

8.Каковы нормативы оценки санитарного состояния воды по титру бактерий группы кишечных палочек?

9.Каковы требования ГОСТ 2874-82 к микробиологическим показателям безопасности питьевой воды?

Лабораторная работа № 8 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОЗДУХА

Воздух закрытых помещений и атмосферный воздух значительно различаются по количественному и качественному составу микроорганизмов. Бактериальная обсемененность, воздуха помещений выше, чем атмосферного.

Микрофлора воздуха формируется в основном за счет почвенных микроорганизмов родов Micrococcus, Bacillus Actinomyces, Penicillium, Aspergillus, Mucor и др., отличающихся большой устой-

чивостью к неблагоприятным факторам внешней среды (высушиванию, ультрафиолетовому излучению, колебаним температуры и пр.). Встречаются и патогенные виды, попадающие в воздух от больных людей и животных воздушно-капельным или воздушно-пылевым путями (при разговоре, кашле, чихании, со слущивающимся эпителием кожных и шерстных покровов, с загрязненного постельного белья и зараженной почвы).

При оценке санитарного состояния воздуха закрытых помещений определяют общее микробное число, а также наличие санитарнопоказательных микроорганизмов (стафилококков, α- и β- гемолитических стрептококков, являющихся показателями загрязнения воздуха микробиоты носоглотки человека). На биотехнологических предприятиях выявляют наличие и содержание микроорганиз- мов-продуцентов (Candida на заводах по производству белково-

59

витаминных концентратов и гидролизно-дрожжевых заводах, Aspergillus и споровых бактерий на ферментных заводах, Bacillus thuringiensis и сальмонелл – при производстве бактериальных средств защиты растений и т.д.).

Нормативов по оценке бактериальной загрязненности воздуха в настоящее время нет. Согласно «Инструкции санитарномикробиологического контроля пивоваренного и безалкогольного производства», воздух производственных помещений считается чистым, если в нем содержится не более 500 микроорганизмов в 1000 л, а в фильтрационном отделении и цехе розлива – не более 50, кроме того, в воздухе отделения чистых культур не должно быть посторонних дрожжей. Воздух, вдуваемый в аппарат чистых культур, не должен содержать посторонних дрожжевых клеток, молочнокислых бактерий, спор плесеней.

При микробиологическом исследовании воздуха следует исходить из основных положений: а) при высоком содержании микроорганизмов в воздухе исследуют небольшие его объемы; б) при низком содержании микроорганизмов или необходимости обнаружения патогенных бактерий и вирусов целесообразно использовать большие объемы воздуха; в) пробы воздуха следует отбирать на уровне дыхания сидящего или стоящего человека.

Для исследования микробиоты воздуха используют различные методы [10, 13].

Методы, основанные на принципе ударно-прибивного действия воздушной струи

Существуют методы, основанные на принципе ударноприбивного действия воздушной струи с использованием специальных приборов, например аппарата Кротова (рис. 8.1).

Аппарат Кротова состоит из цилиндрического корпуса (1), имеющего съемную крышку (9). На основании прибора (2) установлен мотор (3). На оси мотора укреплен центробежный вентилятор (4), внутри ротора которого имеется малая крылатка на шариковом под-

60