Определение активности амилазы мочи по методу Смита-Ро в модификации Уголева.

Принцип метода

Метод основан на определении количества крахмала, расщепляемого амилазой, которое определяется по изменению интенсивности синего окрашивания крахмала в присутствии йода..

Ход определения

Отмеривают 1 мл фосфатного буфера (рН=7,2) и 1 мл 0,15% раствора крахмала, перемешивают встряхиванием и добавляют 0,5 мл мочи, разведенной в «R» раз. Параллельно исследуют контрольную пробу, содержащую 0,5 мл воды вместо мочи (остальные реактивы те же).

Опытные и контрольные пробы инкубируют в термостате при температуре 38⁰ в течение 20 минут. После извлечения из термостата быстро для прекращения реакции добавляют в опытную и контрольную пробы 1 мл 1н соляной кислоты, по 1 мл дистиллированной воды и по 0,2 мл 0,25% раствора йода. Пробирки встряхивают, образовавшуюся синюю окраску фотометрируют против воды при красном светофильтре (640 нм).

Расчет

Оптическую плотность контрольной пробы, содержащей нерасщепленный крахмал, принимают за 100%.

1. Рассчитывают процент нерасщепленного крахмала в опытной пробе по формуле

Х= Д₂ * 100

Д₁

Где Д₁ – оптическая плотность контрольной пробы,

Д₂ – оптическая плотность опытной пробы.

2. Находят процент расщепленного крахмала

У=100% - Х

3. Рассчитывается амилазная активность, которая выражается в условных единицах по формуле:

А (усл.ед.) = У*Р

t

где У – количествао расщепленного крахмала в %

Р – степень разведения мочи ( например, 40, т.е. разведение 1:40)

t - время – продолжительность инкубации в минутах (20 мин).

Примечание: при высокой амилазной активности производится разведение мочи в 100, 200 и более раз. Норма 15-50 условных единиц.

Вывод

Клинико-диагностическое значение метода определения активности амилазы в разных биологических субстратах

a - амилаза /КФ 3.2.1.1./ синтезируется слюнными железами и панкреатической железой. Небольшая активаность фермента, синтезирующегося в лизосомах отмечается также в других органах.

Разделение амилазы крови методом гель - фильтрации на ДЭАЭ – сефадексе выявило 2 изофермента a - амилазы: S -тип - слюнная и Р – тип - панкреатическая. Содержание изоферментов в сыворотке крови: 70% - -тип S и 30% - Р-тип

В моче содержится 70% Р типа, т.к. молекулярная масса Р – типа a- амилазы (48 000- достаточно мала и она фильтруется почками значительно легче.

1. Слюна. Выявление патологий, сопровождающихся поражением слюнных желез.

II. Сыворотка или плазма крови. Можно определить общую активность и соотношение S - и Р – типов. Гиперамилаземия может наблюдаться при остром панкреатите - значительное повышение активности фермента в плазме крови; вирусном гепатите, раке поджелудочной железы, поражении слюнных желез, почечной недостаточности, холецистите, перитоните, ожогах, остром аппендиците, применении некоторых фармакологических препаратов: кортикостероидов, салицилатов, тетрациклина, фуросемида, гистамина.

III. Панкреатический и кишечный сок Диагностика поли и дисахаридазной нелостаточности основана в первую очередь на клинических проявлениях, а также на определении активности ферментов дисахаридаз в биоптатах слизистой оболочки тонкой кишки, определении лактозы, сазарозы в кале, снижении рН кала, проведении нагрузочных тестов.

IU. Моча. Определяется преимущественно Р-тип a - амилазы.Гиперамилазурия имеет место при остром панкреатите, вирусном гепатите, раке поджелудочной железы, желчно-каменной болезни, некрозе панкреатической железы. При острой патологии поджелудочной железы нарастание амилазурии «запаздывает» по сравнению с амилаземией примерно на 6 часов. Имеются данные, что при тяжелом течении панкреатита у части больных активность амилазы мочи может оставаться нормальной, в то время как активность амилазы крови повышается.