Количественное определение глюкозы в крови

Глюкоза является основным углеводом крови человека; ее содержание в цельной крови натощак составляет З,3—5,5 ммоль/л; в сыворотке венозной крови натощак 3,4-6,1 ммоль/л. Другие углеводы фруктоза, манноза, галактоза, лактоза и пентозы — обнаруживаются в значительно меньших или следовых количествах. Под «сахаром крови» в узком смысле слова подразумевают только глюкозу. На уровень глюкозы крови оказывает влияние поступление углеводов с пищей; мобилизация гликогена печени; глюконеогенез; окисление глюкозы в тканях; синтез гетерополисахаридов, пентоз, аминокислот, синтез гликогена и жира и тканях. Глюкоза, являясь одним из важнейших компонентов крови, почти поровну распределяется между плазмой и форменными элементами с некоторым превышением ее концентрации в плазе. Поскольку глюкоза относится к альдогексозам, а альдегидная группа легко окисляется, то это широко используется при определении глюкозы. Для определения глюкозы крови предложено много методов, которые условно можно разделить на 3 группы:

1.Редуктометрические методы основаны на восстанавливающих свойствах глюкозы (метод Хагедорна-Иенсена; Фолина; Фолина-Ву и др.). Недостаток указанных методов заключается в том, что в сущности они определяют не только глюкозу, но и ряд других редуцирующих веществ (глутатион, АДФ, мочевая кислота, креатин, глюкуроновые кислоты, витамин С), присутствие которых может при вести к определению не «чистой глюкозы», а «кажущегося сахара» [Медицинские…, 1999]. Эта группа методов обладает низкой специфичностью и значительной трудоемкостью.

2. Колориметрические методы основаны на цветных реакциях глюкозы с некоторыми соединениями, например серной кислотой, пикринововой кислотой, антроном, ортотолуидином. Этими методами определяются все альдогексозы, но поскольку основным представителем альдогексоз является глюкоза, то получаемые результаты близки к содержанию истинной глюкозы в крови. Недостаток методов - высокая токсичность используемых реактивов.

3. Энзиматические методы являются наиболее специфичными и точными методами количественного определения глюкозы, в частности, глюкозооксидазный метод, с помощью которого определяют содержание «истинной глюкозы», равное З,4—5,6 ммоль/л [Trinder P., 1969; Долгов В.В. и др., 19…, Медицинские…, 1999]. Определение проводят натощак, чтобы избежать пищевой гипергликемии.

В ряде случаев требуется экспресс определение глюкозы крови. Для этих целей используют биохимические анализаторы - глюкометры, позволяющие провести определение глюкозы в течении 2-3 минут после забора крови. В основе работы анализаторов, как правило, лежит глюкозоксидазный метод.

Лабораторная работа № 10

Количественное определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Принцип метода: Глюкозоксидаза специфически катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород воздуха. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярных количествах перекись водорода, которая разлагается вторым ферментом – пероксидазой, а выделяющийся в процессе реакции атомарный кислород окисляет добавленный в реакционную смесь производного фенола с 4-аминофеназином, который изменяет окраску. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию глюкозы [Trinder P., 1969].

Ход определения: в три пробирки отмеривают по 1` мл глюкозового реактива. В первую пробирку прибавляют 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (стандартная проба), во вторую 0,1 мл сыворотки крови (исследуемая проба) и в третью — 0,1 мл дистиллированной воды (контроль). Все пробы перемешивают и инкубируют в течении 15 минут при температуре 37 С. Затем измеряют оптическую плотность пробы и стандарта против контрольного раствора. Светофильтр синий 425-500 нм в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм.

Схема определения глюкозы в сыворотке крови

№ пробы	Глюкозовый реактив (мл)	Стандар- тный р-р глюкозы (мл)	Исследуемая проба (мл)	Н2О (мл)	Условия опыта	Оптическая плотность
1	1	0,1	-	-	Термостатирование 37 гр.С, 15 мин.	Dст
2	1	-	0,1	-		D оп
3	1	-	-	0,1		-

Расчет: С_оп (ммоль/л) = (D_оп/D_ст) • 10

где С_оп - концентрация глюкозы в исследуемой пробе в ммоль/л; С_ст - концентрация глюкозы в стандартном растворе

(10 ммоль/л; D_оп - оптическая плотность раствора исследуемой пробы; D_ст - оптическая плотность раствора стандартной пробы.

Вывод: