4.2. Генетика поведінки інфузорій.
Війчасті одноклітинні Paramecium і Tetrahymena являють собою прекрасні моделі для вивчення генетики поведінки найпростіших. При вивченні цих об'єктів можна використовувати і поведінковий, і електрофізіологічний, і біохімічний і генетичний підхід. Аналіз поведінки найпростіших, як правило, включає вивчення фізіологічного стану клітини, пошук поведінкових мутантів і їхній добір, а також дослідження впливу різних хімічних речовин (лікарських препаратів та ін.).
Оскільки парамеції є досить великими (до 250 мкм у діаметрі), вони легко можуть бути використані для спостереження поведінки, пошуків поведінкових мутантів і електрофізіологічного аналізу. Tetrahymena має порівняно високу швидкість гомологічної рекомбінації й використовується для створення трансгенних ліній і стабільних нокаутних мутантів по окремих генах.
Поведінка найпростіших особливо докладно вивчена на прикладі Paramecium aurelia. Локомоторні реакції парамеції перебувають під контролем поверхневої мембрани. Напрямок і частота биття війок корелюють зі зрушенням електричного потенціалу мембрани, обумовленим змінами потенціалзалежної провідності кальцію. Зміни напряму руху війок викликають зміну напрямку переміщення особини.
Рис. 4.2. Paramecium aurelia.
Репертуар поведінки вільноіснуючих інфузорій полягає в тому, що при дії хімічного або фізичного стимулу вони демонструють зміну напрямку биття війок.
Роль специфічних іонних каналів у каскадній передачі сигналів і в подальших змінах рухливості інфузорій була виявлена при порівнянні клітин дикого типу з деякими поведінковими мутантами.
Учені одержали сотні мутантних ліній Paramecium aurelia. За допомогою поведінкового, електрофізіологічного й генетичного аналізів у цих роботах показані фізико-хімічні механізми адаптивної поведінки найпростіших.
Установлено, що більшість мутацій, які стосуються поведінки, локалізовані в незчеплених локусах і успадковуються згідно законів Менделя. Електрофізіологічний аналіз показав, що наслідком подібних мутацій найчастіше є порушення або зникнення одного або більше іонних струмів, що деполяризують або ре поляризують мембрану при реакції уникнення.
Відомі мутанти Pawn (що значить «пішак», пересування якого шахівницею мають певні обмеження). Вони на відміну від особин дикого типу не можуть плисти назад і можуть бути температурочутливими. Усього виділяють кілька незчеплених локусів, мутанти по яких характеризуються фенотипом Pawn: pwA, pwB, pwC.
Ще одна мутація Paramecium tetraurelia – d4-662,– що спочатку характеризувалася як четвертий локус Pawn, мутація pwD – фактично виявилася алелем pwB (pwB662). Показано також, що алелі pwB взаємодіють між собою.
Мутація Pawn проявляється в специфічному моногенному дефекті, пов'язаному з відсутністю збудливості мембрани, що несе війки. Самі війки при цьому не зачіпаються мутацією. При морфологічних дослідженнях у парамецій були виявлені нитки, що зв'язують основи війок (базальні тільця). Передбачалося, що система цих ниток координує рух війок, однак доказів цьому не отримано.
Прочитання геному інфузорії Tetrahymena thermophila показало, що генетичний код, використовуваний інфузорією, виявився трохи іншим, ніж у всіх інших організмів: стоп-кодони в тетрахімени можуть використовуватися для кодування амінокислот. Крім того, з'ясувалося, що ця інфузорія вміє ефективно видаляти з робочих копій свого генома все «сміття» - повторювані й чужорідні фрагменти. Потомство, однак, завжди одержує в спадщину «неочищений» варіант генома.
Рис. 4.3. Tetrahymena thermophila
У тетрахімени, як у всіх інфузорій, є два клітинних ядра: маленький мікронуклеус, що містить дві копії генома (п'ять пар хромосом), і великий макронуклеус із багаторазово дуплікованим геномом (кілька сотень хромосом).
Мікронуклеус зберігає спадковий матеріал для передачі наступним поколінням, але його гени практично не працюють. Гени макронуклеусу, навпаки, активно працюють - транскрибуються - зчитуються й використовуються для синтезу білків, але вони не можуть бути передані нащадкам.
Інфузорії, як і інші найпростіші, розмножуються поділом, причому діляться обидва ядра. Однак таке безстатеве розмноження не може тривати нескінченно довго: рано чи пізно інфузорії повинні зливатися попарно й обмінюватися спадковим матеріалом. У ході цього статевого процесу (кон'югації) макронуклеус руйнується разом з усіма своїми генами.
В обміні спадковим матеріалом беруть участь тільки мікронуклеуси. Тому наступне покоління інфузорій (те, що утворилося після статевого процесу) одержує лише ті гени, які зберігалися в мікронуклеусах батьків. Мікронуклеус знову ділиться навпіл, і одне з дочірніх ядер починає зростати й перетворюється в новий макронуклеус.
Учені встановили, що в ході утворення макронуклеусу геном не тільки багаторазово дублюється, але й модифікуються: довгі хромосоми розрізаються на більш дрібні, деякі фрагменти генома видаляються, інші міняються місцями.
Дослідникам удалося прочитати геном макронуклеусу. Він виявився несподівано великим, причому не стільки по своїй довжині (105 мільйонів пар основ - це в 30 разів менше, ніж у людини, і приблизно в стільки ж разів більше, ніж у середньостатистичної бактерії), скільки по числу генів. Геном одноклітинної тетрахімени містить понад 27 тисяч генів, які кодую різні білки. Це приблизно стільки ж, скільки геном людини й значно більше, ніж інші прочитані геноми одноклітинних.
Ще одна незвичайна особливість геному інфузорії полягає в надзвичайно низькому змісті повторюваних нуклеотидних послідовностей і мобільних генетичних елементів (транспозонів): вони займають усього 2% генома (для порівняння - у людини - близько 50%).
Функціональна роль повторюваних послідовностей залишається неясною. Можливо, деякі із цих послідовностей важливі для регуляції експресії генів. Крім того, відомо, що численні повтори й мобільні елементи надають геному пластичності і підвищують імовірність різних геномних перебудов (наприклад, транслокацій - переміщень фрагментів ДНК на іншу хромосому або на нове місце в тій же хромосомі).
Вчені прийшли до висновку, що низький вміст повторів і мобільних елементів у геномі макронуклеусу тетрахімени пояснюється тим, що майже все «сміття», наявне у геномі мікронуклеусу, видаляється під час формування великого ядра.
Повтори, мабуть, не потрібні для нормальної роботи генів і для життєзабезпечення організму, вони видаляються з «робочої копії» генома. Але вони передаються нащадкам, можливо для того, щоб геном зберігав пластичність. Імовірно, це адаптація, спрямована на оптимізацію еволюційного процесу.
У геномі інфузорії використовується тільки один стоп-кодон, а не три, як у більшості інших живих організмів. У тетрахімени роль стоп-кодона виконує тільки одна послідовність нуклеотидів - УГА. Два інші класичні стоп-кодони (УАА й УАГ) у тетрахімени кодують амінокислоту глютамін.
Втім, і триплет УГА у тетрахімени не завжди позначає закінчення гена. У деяких випадках (це залежить від нуклеотидного «контексту») ці три нуклеотиди кодують рідкісну амінокислоту селеноцистеїн.
Тетрахімена виявилася єдиним з вивчених на сьогоднішній день організмів, у якого можуть транслюватися всі 64 триплети.
Учені отримали поведінкові мутанти Tetrahymena, нездатні плисти назад внаслідок специфічного нокауту гена, що кодує динеїн.
У Tetrahymena thermophila дикого типу за допомогою відео диференціальної інтерференційної контрастної мікроскопії виявлена цікава поведінкова реакція, що сприяє завершенню цитокінезу. Цей процес, названий ротокінезом, полегшує фізичне розділення дочірніх клітин.
Ротокінез включає постійне односпрямоване обертання однієї з дочірніх клітин, що утворюються, навколо осі, яка проходить уздовж цитоплазматичного містка, що з'єднує дочірні клітини. Припускають, що обертаючий момент, генерований ротокінезом, може послабляти цитоплазматичний місток між дочірніми клітинами, тим самим збільшуючи ймовірність успішного цитокінезу. Механізм, що забезпечує саме таке фінальне розділення клітин наприкінці цитокінезу вивчений не повністю.
Нокаутні по генах, що кодують kinesin-II гомологичні молекулярні мотори Kin1p і Kin2p, лінії Tetrahymena thermophila є паралізованими внаслідок повної втрати війок і характеризуються частим порушенням цитокінезу. Спостереження за живими клітинами, які діляться, показали, що формування борозни розподілу в подвійних kinesin-II нокаутів іде нормально аж до останньої стадії поділу клітин.
У тетрахімены описана також мутація dcc (defective in ciliogenesis and cytokinesis – дефект біогенезу війок і цитокінезу), внаслідок якої в особин спостерігаються порушення біогенезу війок. Вони нездатні відновлювати рухливість після дециліації й нездатні до повноцінного цитокінезу.
Переваги Paramecium і Tetrahymena формують основу для генетичного аналізу функціональних компонентів сенсорної трансдукції й адаптаційних реакцій цих істот.