- •Биологическая
- •2. Забор крови для лабораторных исследований.
- •3. Правила лабораторных исследований.
- •4. Ошибки при проведении лабораторных исследований.
- •Методы биохимических исследований
- •Тема 1. Введение в биохимию. Биохимические компоненты клеток
- •Белки. Состав и свойства белков
- •Тема 2. Ферменты и коферменты
- •Тема 3, 4. Основные закономерности метаболизма. Цикл Кребса. Молекулярные основы биоэнергетики
- •Тема 1. Метаболизм углеводов и его регуляция
- •Тема 2. Метаболизм липидов и его регуляция
- •Тема 3. Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена
- •Тема 1, 2. Основы молекулярной биологии. Основы молекулярной генетики
- •Тема 3, 4. Молекулярные механизмы действия гормонов на клетки-мишени. Биохимия гормональной регуляции метаболизма
- •Работа 1. Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина
- •Работа 2. Качественная реакция на тироксин
- •Тема 1. Биохимия питания человека. Витамины как компоненты питания
- •Работа 6. Реакции на витамин р (рутин)
- •Работа 2. Количественное определение витамина а в рыбьем жире
- •Тема 2. Биохимия и патобиохимия крови
- •Тема 3. Функциональная и клеточная биохимия органов и тканей.
- •Литература:
- •Тема 1. Введение в биохимию. Биохимические компоненты клеток 21
Тема 3. Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена
В живых организмах постоянно происходит интенсивное обновление белковых молекул. Образующиеся при гидролизе эндогенных белков аминокислоты могут использоваться для биосинтеза новых белков или для синтеза биологически важных азотсодержащих соединений (пуриновых и пиримидиновых оснований, некоторых гормонов и др.).
Белковый обмен в организме человека и животных в значительной мере зависит от поступления с пищей достаточного количества белков, содержащих полный набор незаменимых аминокислот (полноценные белки). Для человека незаменимыми аминокислотами являются лизин, аргинин, гистидин, валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин, триптофан.
Белки пищи, поступая в организм, подвергаются в пищеварительном тракте гидролитическому расщеплению до аминокислот, которые в результате всасывания в тонком кишечнике поступают в кровь, и, через воротную вену, далее в печень, где включаются в тканевой обмен. Часть аминокислот из печени поступает в систему кровообращения и утилизируется тканями, а часть дезаминируется и превращается или в ацетил-КоА (кетогенные аминокислоты), или в метаболиты цикла Кребса и пируват (гликогенные).
В тканях аминокислоты используются для синтеза белков или подвергаются дезаминированию, трансаминированию, декарбоксилированию, метилированию, в зависимости от того, используются они для синтеза специализированных биологически активных соединений (см. таблицу) или участвуют в энергетическом обмене.
Катаболизм большинства аминокислот начинается с реакций трансаминирования (обратимый перенос аминогруппы от -аминокислоты на -кетокислоту), катализируемых аминотрансферазами. Аминогруппы различных аминокислот при трансаминировании переносятся, в основном, на -кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой кислоты, которая далее может подвергаться окислительному дезаминированию до иминокислоты, а затем гидролитически расщепляется на кетокислоту (-кетоглутаровая кислота) и аммиак. Эта реакция катализируется глутаматдегидрогеназой.
Аминокислоты |
Производные |
Суммарно |
Белки, полипептиды, гормоны пептидной природы, нейромедиаторы и др. |
Тирозин |
Катехоламины, тироксин |
Триптофан |
Серотонин |
Гистидин |
Гистамин |
Глутамат |
-аминомасляная кислота |
Глицин, аргинин, метионин |
Креатин |
Метионин, серин |
Холин |
Глицин |
Порфирины |
Глицин, аспартат |
Нуклеотиды |
Глицин, аланин, серин, триптофан, валин, аспартат, глутамат и др. |
Углеводы |
Фенилаланин, тирозин, лейцин, лизин, триптофан и др. |
Липиды |
Орнитин, цитруллин, аргинин, аспартат |
Мочевина |
Высвобождающийся аммиак используется для восстановительного аминирования кетокислот, синтеза пиримидиновых нуклеотидов и некоторых других веществ. При накоплении аммиак весьма токсичен и в организме имеется ряд механизмов, обезвреживающих аммиак. В печени осуществляется основной механизм обезвреживания аммиака – синтез мочевины, которая является главным конечным продуктом белкового обмена в организме человека и значительно менее токсична, чем другие азотсодержащие продукты обмена. Дополнительным механизмом является связывание аммиака глутаминовой и аспарагиновой кислотами с образованием амидов (глутамина и аспарагина). Глутамин представляет собой транспортную форму аммиака у животных. В виде глутамина аммиак транспортируется в печень и почки.
Исследование содержания небелкового азота сыворотки крови и мочи, а также соотношения белкового и небелкового азота в крови позволяют судить об обмене белков в организме и отдельных тканях, о балансе процессов биосинтеза и деградации белка. Основной вклад в небелковый азот крови вносят мочевина (50–60 %), а также свободные аминокислоты и нуклеотиды, креатин, билирубин, мочевая кислота. В общий азот мочи включают сумму всех азотсодержащих веществ: мочевина (80–90 %), аммонийные соли (4–6 %), креатинин (2–7 %), а также индикан, гиппуровая кислота, глюкуроновая кислота, мочевая кислота и свободные аминокислоты.
Лабораторная работа 10. Определение активности аминотрансфераз
Активность аминотрансфераз (прежде всего аланин- и аспартатаминотрансферазы – АлАТ и АсАТ соответственно) рассматривается как один из важных показателей обмена белков и аминокислот.
Принцип метода: при трансаминировании α-кетоглутарата и L-аланина под действием АлАТ, образуются пируват и L-глутаминовая кислота. Определение основано на измерении оптической плотности 2,4-динитрофенилгидразонов α-кетоглутарата и пирувата в щелочной среде. Поскольку гидразон пировиноградной кислоты имеет более высокий коэффициент молярной экстинкции, то проявляется прямо пропорциональная зависимость оптической плотности реакционного раствора от активности фермента.
Материалы и реактивы:
1. Субстратно-буферный раствор АлАТ:
фосфатный буфер (0,1 0,005) мМ,
D, L- аланин (0,2 0,01) М,
2-оксоглутаровая кислота (2 0,1) М;
2. Стоп–реагент (раствор 2,4-динитрофенилгидразина – (1 0,05) мМ в растворе соляной кислоты (1 0,05) мМ;
3. Калибровочный раствор – пировинограднокислого натрия (2 0,1) мМ, (220 11) мг/мл (что соответствует 176 мкг/мл пировиноградной кислоты);
4. Раствор гидроокиси натрия (4 0,2) М или сухой NaOH.
Ход работы:
Анализ проводиться согласно схеме, приведенной в таблице 1.
Таблица 1
Отмерять в пробирку, мл |
Опытная или калибровочная проба |
Холостая проба |
Субстратно-буферный раствор |
0,4 |
0,4 |
Инкубировать 3 мин при +37 0С | ||
Стоп–реагент |
– |
0,4 |
Сыворотка крови |
0,08 |
0,08 |
Инкубировать 60 мин при +37 0С | ||
Стоп–реагент |
0,4 |
– |
Выдерживать 20 мин при комнатной температуре | ||
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н |
4,0 |
4,0 |
Выдерживать 10 мин при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой при длине волны 500–550 нм. |
Расчет активности фермента в сыворотке крови проводят по калибровочному графику. Построение калибровочного графика проводится в соответствии с таблицей 2.
Таблица 2. Калибровочный график для 1 часа инкубации
Отмерять в пробирку, мл |
Калибровочные точки |
Контрольная проба | ||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 | ||
Субстратно-буферный раствор |
0,45 |
0,40 |
0,35 |
0,30 |
0,25 |
0,5 |
Калибровочный раствор |
0,05 |
0,10 |
0,15 |
0,2 |
0,25 |
– |
Дистиллированная вода или физиологический раствор |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
0,1 |
Стоп–реагент |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Выдержать 20 мин при комнатной температуре | ||||||
Раствор гидроокиси натрия 0,4 Н |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
5,0 |
Выдержать 10 мин. при комнатной температуре. Измерить оптическую плотность калибровочных проб против контрольной пробы. Фотометрирование проводится, как для опытного образца. При построении калибровочного графика на оси абсцисс – величины активности АлАТ, выраженные в микромолях пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации. | ||||||
Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе |
|
|
|
|
|
|
Мкмоль |
0,1 |
0,2 |
0,3 |
0,4 |
0,5 |
0,0 |
Мкг |
8,8 |
17,6 |
26,4 |
35,2 |
44,0 |
0,0 |
Активность в мкмоль/часмл |
1,0 |
2,0 |
3,0 |
4,0 |
5,0 |
0,0 |
мккат/л |
0,278 |
0,556 |
0,833 |
1,11 |
1,39 |
0,0 |
Линейность калибровочного графика должна сохраняться до величины экстинкции 0,35.
Нормальная активность АлАТ в сыворотке крови составляет (0,1–0,68) мкмоль/часмл при + 37 0С.
Клинико-диагностическое значение. Диагностическое значение имеют две аминотрансферазы: АлАТ и АсАТ. Повышение их активности в крови является чувствительным показателем нарушения функций печени и сердца.
Для диагностики инфаркта миокарда проводят определение активности следующих ферментов: креатинкиназы, ЛДГ, АсАТ, АлАТ. При инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке крови поднимается, начиная с 8–12 часа; максимальная активность достигается через 24–36 часов, а её возвращение к нормальному уровню происходит на 4–6 день. У больных с инфарктом миокарда активность АсАТ в сыворотке крови в 2–10 раз выше верхнего значения нормы. Соотношение активности АлАТ/АсАТ при инфаркте миокарда в большинстве случаев превышает 2, а соотношение меньше 1 преимущественно указывает на поражения печени.
Повышенная активность ферментов в сыворотке крови при заболеваниях печени является следствием повреждения гепатоцитов. Такие повреждения, независимо от причины, вызывают увеличение активности аминотрансфераз не менее, чем в 10 раз. Токсическое повреждение печени, например, при отравлении парацетамолом, приводит к повышению активности АлАТ и АсАТ в 50–100 раз. Значительное возрастание активности аминотрансфераз выявляют при вирусном гепатите.
Активность АлАТ и АсАТ при некоторых заболеваниях
Фер-мент |
Заболевание | ||||||
Инфаркт миокарда |
Стено- кардия |
Мио-кардит |
Острый гепатит |
Хрони-ческий гепатит |
Цирроз печени |
Обтураци-онная желтуха | |
АсАТ |
++ |
± |
± |
+ |
± |
± |
+ или ± |
АлАТ |
± |
± |
+ |
++ |
± |
± |
+ или ± |
+ – норма ± – активность фермента повышена ++ – активность фермента сильно повышена |
Лабораторная работа 11. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
Мочевина – основной конечный продукт азотистого катаболизма в организме млекопитающих. Содержание мочевины в плазме крови – важный показатель состояния печени, где она образуется при обезвреживании аммиака, и почек, регулирующих ее поступление в мочу (при этом некоторая часть ее может реабсорбироваться). Кроме того, концентрация мочевины отражает соотношение между азотистым катаболизмом и анаболизмом в организме.
Принцип метода: Мочевина образует с диацетилмонооксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и солей Fе3+ комплекс красного цвета, по интенсивности окраски которого определяют концентрацию мочевины.
Материалы и реактивы:
раствор диацетилмонооксима;
раствор тиосемикарбазида;
2) калибровочный раствор мочевины – 16,65 мМ;
3) раствор трихлоруксусной кислоты 50 %;
4) раствор серной кислоты 15 %.
Анализируемый образец: сыворотка крови, моча (разведенная в 50 или 100 раз)
.Ход работы: работу проводят согласно таблице.
|
Опытная проба |
Эталон |
Холостая проба |
Сыворотка крови или развед. моча |
0,02 |
– |
– |
Эталон мочевины (раствор) |
– |
0,02 |
– |
Физиологический раствор |
– |
– |
0,02 |
Раствор диацетилмонооксима |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Раствор тиосемикарбазида |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
В пробирки отмеряют последовательно, согласно таблице, анализируемый образец и рабочие растворы. Для уменьшения ошибки анализа рекомендуется придерживаться указанного порядка смешивания растворов.
Пробирки закрыть алюминиевой фольгой и поставить в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем охладить их и измерить на ФЭКе оптическую плотность пробы (Еопыт) и эталона (Еэталон) против холостой пробы при длине волны 540–560 нм.
Расчет концентрации мочевины в опытной пробе
,
где Сэталон – концентрация мочевины в эталоне – равна 16,65 мМ
В норме содержание мочевины в сыворотке крови составляет 1,7–8,32 мМ, 10–50 мг/дкл.
Расчет мочевины в суточной моче:
Сг/сутки=Сопыт,
где А – суточное количество мочи, мл;
В – количество мочи, взятое для анализа, мл;
К – коэффициент разведения мочи;
1000 – коэффициент перевода величины экскреции мочевины из мг в г.
В норме содержание мочевины в моче составляет 333–583 мМ/сутки, 20–35 г/сутки.
Клинико-диагностическое значение. Отклонения от нормального содержания мочевины зависит от скорости процессов синтеза мочевины и её выведения. Содержание мочевины в сыворотке крови и моче может изменятся вследствие поражения некоторых органов, главным образом печени и почек.
Повышенное содержание мочевины в сыворотке крови – уремию – наблюдают при заболеваниях почек. При этом содержание мочевины в моче уменьшается. Уремию наблюдают также при патологиях, которые сопровождаются интенсивным распадом белка (сепсис, туберкулёз, ожоги, перитониты). Содержание мочевины в моче при этом возрастает.
Кроме того, возрастание уровня мочевины в сыворотке крови может происходить в случае потери жидкости (рвота, диарея, обезвоживание).
Нарушение мочевинообразующей функции печени вследствие цирроза, острого жирового гепатоза, отравления фосфором, мышьяком и другими ядами приводит к уменьшению синтеза мочевины, снижению содержания её в крови и уменьшением выведения её с мочой. В этих случаях увеличивается выделение с мочой и других азотсодержащих веществ: аминокислот, креатинина, аммиака и т. д.
Содержание мочевины в биологических жидкостях зависит также от характера питания: при употреблении богатой белками пищи содержание мочевины в сыворотке крови и моче увеличивается, в случае безбелковой диеты – уменьшается.
Уровень мочевины в биологических жидкостях может изменяться под действием некоторых препаратов. Увеличивается содержание мочевины в крови при приёме анаболических стероидов, а также под действием нефротоксичных лекарственных препаратов.
Контрольные вопросы по теме «Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена»:
Пул свободных аминокислот в организме: пути поступления и использование свободных аминокислот в тканях.
Трансаминирование аминокислот: реакции и их биохимическое значение, механизмы действия аминотрансфераз.
Прямое и косвенное дезаминирование свободных L-аминокислот в тканях.
Декарбоксилирование L-аминокислот в организме человека. Физиологическое значение образовавшихся продуктов. Окисление биогенных аминов.
Пути образования и обезвреживания аммиака в организме.
Биосинтез мочевины: последовательность ферментных реакций биосинтеза, генетические аномалии ферментов цикла мочевины.
Общие пути метаболизма углеродных скелетов аминокислот в организме человека. Глюкогенные и кетогенные аминокислоты.
Биосинтез и биологическая роль креатина и креатинфосфата. Креатинин.
Глутатион: строение, биосинтез и биологические функции глутатиона.
Специализированные пути метаболизма циклических аминокислот – фенилаланина и тирозина.
Наследственные энзимопатии обмена циклических аминокислот – фенилаланина и тирозина.
Обмен циклической аминокислоты триптофана и его наследственные энзимопатии.
МОДУЛЬ 3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ. БИОХИМИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОММУНИКАЦИЙ