Работа 1. Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина

В 3 пробирки внести по 3 капли препарата инсулина и про­вести реакции: биуретовую, Миллона и Фоля.

Работа 2. Качественная реакция на тироксин

Тироксин можно обнаружить в препарате тиреоидина, получаемого из щитовидной железы крупного рогатого скота. Обнаруживают тироксин следующим образом: отщепляют от него с помощью кислотного гидролиза йодоводородную кислоту и переводят ее в свободный йод. Последний экстрагируют хлороформом, который окрашивается при этом в фиолетовый цвет.

Ход работ. В пробирку внести полтаблетки тиреоидина и 10 капель НNO₃. Осторожно нагреть 1–2 мин. Затем добавить 20 капель 1 % KIO₃ (иодат калия), перемешать и охладить. KIO₃ окисляет освободившуюся при гидролизе йодоводородную кислоту в свободный иод.

5НI + KIO₃ + HNO₃ = 3I₂↑ + KNO₃+3Н₂О

В пробирку добавить 1–2 мл хлороформа и хорошо встряхнуть. После отстаивания слой хлороформа (нижний) окрашивается в фиолетовый цвет.

Работа 3. Качественные реакции на адреналин

Раствор адреналина: (содержимое ампулы 0,1 %) растворить в 100 мл воды.

Адреналин образуется из тирозина при участии метионина (донор метильной группы). При образовании адреналина кольцо тирозина превращается в пирокатехиновое кольцо (оно легко окисляется, об­разуя различные цветные соединения). Это и используется во мно­гих цветных реакциях на адреналин.

1. Диазореакция. Ход работы. В пробирку поместить 3 капли 1 % раствора сульфаниловой кислоты, 3 капли 5 % раствора азотистокислого Na, 5 капель раствора адреналина (1 : 1000) и 3 капли 10 % раствора углекислого Na. Жидкость окрашивается в красный цвет.

2. Реакция с йодатом калия. Ход работы. В пробирку внести 3 капли адреналина (1 : 1000), 2–3 капли 10 % раствора KIO₃ и 2 капли 10 % CH₃COOH. Жидкость слегка нагреть. Появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Результаты исследования гормонов оформить в виде таблицы:

Железа внутренней секреции	Гормон	Химическое строение	Метаболи­ческая роль	Употребля­емые реактивы	Получаемое окрашивание

Определение концентрации адреналина

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина. Реактив Фолина состоит из солей фосфорно-вольфрамовой и фосфорно-молибденовой кислот. Эти соли при взаимодействии с фенолами восстанавливаются с образованием более низких окислов, комплексы которых окрашены в синий цвет.

Ход работы. В сухую пробирку внести 1 мл исследуемого раствора, 4 мл 10 % раствора Na₂CO₃ и 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое встряхнуть. Через 3–5 мин появляется синяя окраска. Экстинкцию изме­рить на ФЭК против контроля (контроль – 1 мл Н₂О, 4 мл 10 % Na₂CO₃ и 0,5 мл реактива Фолина) при длине волны 650 нм (620–700 нм). Количество адреналина определить по калибровочному графику.

Калибровочная для определения адреналина

В мерную колбу емкостью 25 мл вносят точно 1 мл коммерческого адреналина. Доводят до метки водой. 1 мл стандартного раствора содержит 0,04 мг адреналина, что соответствует концентрации 4 мг%. Этот раствор разводят следующим образом:

Номера пробирок	Контроль	1	2	3	4
Стандартный раствор адреналина (мл)	0	1	0,75	0,5	0,25
H2O (мл)	1	0	0,25	0,5	0,75
Концентрация адреналина (г/л)	0	0,04	0,03	0,02	0,01
Оптическая плотность раствора (Е)

Лабораторная работа 4. Количественное определение общего кальция в биологических жидкостях

Функции кальция в организме разнообразны и обеспечиваются особенностями его распределения и химическими свойствами ионов, в частности способностью специфично и крепко связываться с белками. Соли кальция обеспечивают жёсткую структуру костей и зубов. Органической основой кости являются коллаген, гликозаминогликаны и др. Кристаллы солей кальция в кости связаны с поверхностью органического матрикса. Ионы минерального компонента костей постоянно обмениваются путём диффузии с ионами межклеточной жидкости и плазмы крови, благодаря чему костная ткань служит депо минеральных солей организма, особенно кальция.

Ионы кальция играют роль вторичного посредника в реализации ответа клеток на внешние сигналы (нервные, гормональные и т. д.). При действии сигналов открываются кальциевые каналы, и содержание ионов кальция в цитоплазме возрастает в тысячи раз. Ионы связываются со специфическими внутриклеточными белками, запускают цепь реакций, что приводит к физиологическому ответу клетки. Такими Са²⁺-связывающими белками являются тропонин С (регуляция сокращения скелетных мышц и миокарда), легкая цепь миозина (регуляция сокращения гладкой мускулатуры), витамин D-зависимый белок (регуляция всасывания кальция в кишечнике), белок S-100 нервной ткани (регуляция фосфорилирования белков), кальмодулин (образование комплекса с ионами кальция, который активирует многие ферменты). С прекращением действия внешнего сигнала Са²⁺-АТФазы выкачивают ионы кальция из цитоплазмы, активный комплекс диссоциирует и активность ферментов снижается. Ионы кальция принимают участие в процессе свёртывания крови. Ионы кальция влияют на порог возбудимости нервных клеток.

Концентрацию ионов кальция в плазме крови регулируют паратгормон и кальцитонин, а также производное витамина D (1,25-диоксихолекальциферол) – кальцитриол. Паратгормон стимулирует процесс резорбции костной ткани и выхода кальция и фосфатов в кровь, а кальцитонин тормозит этот процесс. Синергистом паратгормона в действии на костную ткань является кальцитриол, который в свою очередь стимулирует всасывание кальция в кишечнике. В почках паратгормон стимулирует реабсорбцию Са²⁺ дистальными канальцами. Таким образом, эффективность регуляции гомеостаза Са²⁺ зависит от функционирования паращитовидных и щитовидной желёз, почек, кишечника и поступления в организм кальция и витамина D.

Принцип метода: ионы кальция в щелочной среде вступают в реакцию с -крезолфталеин-комплексоном, образуя окрашенный комплекс. Интенсивность фиолетовой окраски образующегося комплекса пропорциональна концентрации кальция в анализируемой пробе.

Материалы и реактивы:

1. Хромоген:

• -крезолфталеин комплексон (0,12  0,01) мМ;

• -оксихинолин (16,0  0,16)мМ;

• соляная кислота (60,0  6,00) мМ

2. Буфер: моноэтаноламин (0,8  0,08) мМ

3. Калибровочный раствор кальция (2,5  0,05) мМ или 0,1 г/л

Образец: сыворотка крови, плазма крови (антикоагулянт – гепарин); суточная моча.

Ход работы. Анализ проводится в соответствии со схемой, представленной в таблице

Отмерить в кювету, мл	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
Хромоген	2,50	2,50	2,50
Образец	–	–	0,02
Калибровочный раствор	–	0,02	-
Буфер	2,50	2,50	2,50
Н2О дист.	0,02	–	–
Смешать и выдержать (10  1) мин при комнатной температуре (от +20 до +25 0С). Оптическую плотность опытной (Еопыт.) и калибровочной пробы (Екалибр.) измерить против холостой не позднее (30  5) мин при 550–590 нм в кювете с длиной оптического пути 5 или 10 мм.

Расчет результатов провести по формуле:

Кальций (мМ) = 2,5  Е_опыт / Е_{калибр.}

или

Кальций (г/л) = 0,1  Е_опыт / Е_{калибр.}

Для расчета концентрации кальция в суточной моче полученное выше значение (мМ) умножают на объем суточной мочи, выраженный в л (получают ммоль/сут.), или значение (г/л) умножают на объем суточной мочи, выраженный в л, и коэффициент 10 (получают г/сут.).

Нормальные величины содержания кальция:

Сыворотка	г/л	мМ
9–10 дней	0,076–0,104	1,90–2,60
10 дней–24 месяца	0,090–0,110	2,25–2,75
24 месяца–12 лет	0,088–0,108	2,20–2,70
12–18 лет	0,040–0,102	2,10–2,55
18–60 лет	0,086–10,0	2,15–2,50
60–90 лет	0,088–0,102	2,20–2,55
старше 90 лет	0,082–0,096	2,05–2,40
Моча, суточная норма	г/сут.	мМ/сут.
Отсутствие Са в диете	0,005–0,04	0,13–1,00
Потребление Са ниже среднего уровня	0,05–1,5	1,25–3,75
Средний уровень потребления Са – 0,800 г/сут. (20 мМ/сут.)	0,1–0,3	2,50–7,50

Клинико-диагностическое значение.

В норме концентрация кальция в сыворотке крови здорового человека составляет 2,2–2,6 мМ.

Концентрация кальция в сыворотке крови уменьшается (гипокальциемия) при гипопаратиреозе, дефиците витамина D, заболеваниях почек. Клинические проявления гипокальциемии: неврологические нарушения (онемение, тетания, умственные расстройства), нарушения сердечно-сосудистой деятельности, катаракты.

Гиперкальциемия может быть следствием интоксикации витамином D, гиперпаратиреозе, тиреотоксикозе. Опасный для жизни уровень кальция в сыворотке крови при гиперкальциемии составляет 3,75 мМ. Клинические симптомы выраженной гиперкальциемии: запор, рвота, полиурия, сонливость и кома.

Лабораторная работа 5. Количественное определение содержания неорганического фосфора в биологических жидкостях

В организме человека содержатся органические и неорганические фосфаты. 85 % фосфатов содержится в костях. Фосфорные группы есть в фосфопротеидах, нуклеиновых кислотах, фосфолипидах, нуклеотидных коферментах. Важное биологическое значение имеют макроэргические фосфаты – АТФ, АДФ, креатинфосфат. Моно- и дигидрофосфаты калия или натрия образуют фосфатную буферную систему. Регуляция обмена фосфатов осуществляется вместе с кальцием. Усиливая остеолиз, паратгормон увеличивает содержание фосфатов в крови. Кальцитонин тормозит процесс остеолиза. В почках паратгормон снижает реабсорбцию фосфатов.

Принцип метода: неорганический фосфат образует с молибденовой кислотой в сильно кислой среде фосфомолибденовую кислоту, восстанавливающуюся в присутствии железа (ІІ) в молибденовую синь. Осаждаемые индикаторным реагентом белки растворяются при добавлении стабилизатора – триэтаноламина. Оптическая плотность реакционного раствора пропорциональна концентрации неорганического фосфора в пробе.

Материалы и реактивы:

1. Индикаторный реагент: молибдат аммония (402) мМ,

серная кислота (50,25) М,

стабилизаторы, активаторы;

2. Раствор стабилизатора: триэтаноламин (3,420,17) М;

3. Калибровочный раствор фосфора (1,6150,08) мМ или 50 мкг/л.

Образец: сыворотка крови; суточная моча, разведенная дистиллированной водой в 20 раз.

Ход работы. Анализ проводится в соответствии с таблицей.

Отмерить в кювету, мл	Опытная проба	Калибр. проба	Холостая проба
Образец	0,10	–	–
Калибровочный раствор	–	0,10	–
Дистиллированная вода	–	–	0,10
Индикаторный реагент	2,00	2,00	2,00
Перемешать и выдержать, при температуре от +20 0С до +25 0С, 15 мин. Выпавший осадок белка растворяется на следующей стадии пипетирования.
Раствор стабилизатора	2,00	2,00	2,00
Перемешать, выдержать 5–6 мин при комнатной температуре (от +20 0С до +25 0С) и измерить оптическую плотность опытной (Еопыт.), и калибровочной пробы (Екалиб.) против холостой (окраска устойчива в течение 30 мин) при длине волны 570–660 нм в кюветах толщиной 10 мм. Если после добавления раствора стабилизатора раствор не очистился – необходимо добавить в каждую пробирку по одной капле 1 М NaOH.

Расчет концентрации фосфора :

,

где 1,615(50) – концентрация фосфора в калибровочном растворе, мМ (мкг/л);

Е_опыт. – оптическая плотность исследуемой пробы, ед. опт. плотности;

Е_калиб. – оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. плотности;

С – концентрация фосфора в исследуемой пробе, мМ (мкг/л).

Полученную концентрацию фосфора в моче необходимо умножить на коэффициент разведения – 20.

Нормальное содержание фосфора:

Сыворотка	мМ	мкг/л
Взрослые 12–60 лет	0,87–1,45	27–45
Мужчины старше 60 лет	0,74–1,20	23–37
Женщины старше 60 лет	0,90–1,32	28–41
Новорожденные	1,45–2,91	45–90
Моча	29–48 ммоль/сут.,	0,9–1,5 г/сут.

Клинико-диагностическое значение.

Гипофосфатемия развивается при недостатке витамина D в случае стеатореи (экскреция с калом жиров приводит к недостатку витамина D). Возникает при ряде заболеваний печени и поджелудочной железы. Выраженная гипофосфатемия наблюдается при гиперпаратиреозе. При этом ингибирована реабсорбция фосфатов в почечных канальцах и, следовательно, увеличена их экскреция.

Умеренное снижение фосфатов в крови наблюдают при заболеваниях почек. Снижается реабсорбция фосфатов в почечных канальцах, развивается фосфатурия.

Случаи гиперфосфатемии отмечают при гипопаратиреозе, хронической почечной недостаточности, метастазах в костной ткани.

Контрольные вопросы по теме «Молекулярные механизмы действия гормонов на клетки-мишени»:

1. Гормоны: общая характеристика; роль гормонов и других биорегуляторов в системе межклеточной интеграции функций организма человека.

2. Классификация гормонов и биорегуляторов: соответствие структуры и механизмов действия гормонов.

3. Реакция клеток-мишеней на действие гормонов. Мембранные (ионотропные, метаботропные) и цитозольные рецепторы.

4. Биохимические системы внутриклеточной передачи гормональных сигналов: G-белки, эффекторные белки, вторичные посредники (цАМФ, Са²⁺, кальмодулин, ИФ₃, ДАГ).

5. Молекулярно-клеточные механизмы действия стероидных и тиреоидных гормонов.

Контрольные вопросы по теме «Биохимия гормональной регуляции метаболизма»:

1. Гормоны гипоталамуса – либерины и статины.

2. Гормоны передней части гипофиза: соматотропин (СТГ), пролактин, патологические процессы, связанные с нарушением функции этих гормонов.

3. Гормоны задней доли гипофиза. Вазопрессин и окситоцин: строение, биологические функции.

4. Инсулин: строение, биосинтез и секреция; влияние на обмен углеводов, липидов, аминокислот и белков. Ростстимулирующие эффекты инсулина.

5. Глюкагон: регуляция обмена углеводов и липидов.

6. Тиреоидные гормоны: структура, биологические эффекты Т₄ и Т₃. Нарушение метаболических процессов при гипо- и гипертиреозе.

7. Катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин): строение, биосинтез, физиологические эффекты, биохимические механизмы действия.

8. Стероидные гормоны коры надпочечников (С₂₁-стероиды) – глюкокортикоиды и минералокортикоиды; строение, свойства.

9. Женские половые гормоны: эстрогены, прогестерон. Физиологические и биохимические эффекты, связь с фазами овуляционного цикла.

10. Мужские половые гормоны (С₁₉-стероиды). Физиологические и биохимические эффекты андрогенов; регуляция синтеза и секреции.

11. Гормональная регуляция гомеостаза кальция в организме. Паратгормон, кальцитонин, кальцитриол.

12. Эйкозаноиды: строение, биологические и фармакологические свойства. Аспирин и другие нестероидные противовоспалительные средства как ингибиторы синтеза простагландинов.

МОДУЛЬ 4. БИОХИМИЯ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ