- •Биологическая
- •2. Забор крови для лабораторных исследований.
- •3. Правила лабораторных исследований.
- •4. Ошибки при проведении лабораторных исследований.
- •Методы биохимических исследований
- •Тема 1. Введение в биохимию. Биохимические компоненты клеток
- •Белки. Состав и свойства белков
- •Тема 2. Ферменты и коферменты
- •Тема 3, 4. Основные закономерности метаболизма. Цикл Кребса. Молекулярные основы биоэнергетики
- •Тема 1. Метаболизм углеводов и его регуляция
- •Тема 2. Метаболизм липидов и его регуляция
- •Тема 3. Метаболизм аминокислот. Энзимопатии аминокислотного обмена
- •Тема 1, 2. Основы молекулярной биологии. Основы молекулярной генетики
- •Тема 3, 4. Молекулярные механизмы действия гормонов на клетки-мишени. Биохимия гормональной регуляции метаболизма
- •Работа 1. Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина
- •Работа 2. Качественная реакция на тироксин
- •Тема 1. Биохимия питания человека. Витамины как компоненты питания
- •Работа 6. Реакции на витамин р (рутин)
- •Работа 2. Количественное определение витамина а в рыбьем жире
- •Тема 2. Биохимия и патобиохимия крови
- •Тема 3. Функциональная и клеточная биохимия органов и тканей.
- •Литература:
- •Тема 1. Введение в биохимию. Биохимические компоненты клеток 21
Тема 1, 2. Основы молекулярной биологии. Основы молекулярной генетики
Нуклеиновые кислоты — биополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды, соединенные между собой фосфодиэфирными связями. Нуклеотиды состоят из трех компонентов: азотистого основания (аденина, гуанина, цитозина, урацила или тимина), моносахарида (D-рибозы или 2-дезокси-D-рибозы) и фосфорной кислоты. В зависимости от типа мономерных звеньев (дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды), входящих в состав нуклеиновых кислот, различают дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) кислоты. Молекулы ДНК, как правило, состоят из 2-х полинуклеотидных цепей, тогда как молекулы РНК, в основном, одноцепочечные.
Оба типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) присутствуют во всех клеточных организмах, и только вирусы могут содержать один тип полимера.
Функции нуклеиновых кислот состоят в хранении, передаче и реализации генетической информации.
У эукариотических организмов ДНК локализована, в основном, в ядрах клеток, у прокариот она образует нуклеоид, в котором содержится вся бактериальная хромосома. Митохондрии и хлоропласты содержат свою собственную ДНК. Кроме того, в цитоплазме многих прокариот и низших эукариот обнаружены внехромосомные ДНК – плазмиды.
В клетках как про-, так и эукариот РНК бывают трех основных типов: информационная (матричная, мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК). мРНК является матрицей для синтеза белка. тРНК переносят специфические аминокислоты к месту белкового синтеза и, собственно, переводят последовательность нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислотых остатков полипептида. рРНК являются структурно-функциональной основой рибосом.
Лабораторная работа 1. Определение состава нуклеопротеидов
В клетке нуклеиновые кислоты, в основном, находятся в комплексе с белками, т. е. в виде нуклеопротеидов. В зависимости от типа нуклеиновой кислоты различают дезоксирибонуклеопротеиды – хроматин, и рибонуклеопротеиды – рибосомы, информосомы, РНК-содержащие вирусы.
Гидролиз нуклеопротеидов дает возможность установить их химический состав с помощью качественных реакций.
Одним из источников для выделения нуклеопротеидов являются дрожжи.
1. Биуретовая реакция. К 5-ти каплям гидролизата добавить 10 капель 10 % раствора NaOH и 1 каплю СuSO4. Фиолетовое окрашивание свидетельствует о наличии в гидролизате пептидов.
2. Проба на пуриновые основания. 10 капель гидролизата нейтрализовать одной каплей концентрированного раствора NH4OH и добавить 5 капель 1 % раствора АgNО3. Через несколько минут образуется рыхлый осадок соединений пуриновых оснований с серебром, окрашенный в бурый цвет.
3. Качественная реакция на углеводный компонент. К 5–7 каплям гидролизата добавить 1–2 капли -нафтола, перемешать и осторожно наслоить 0,5 мл концентрированной H2SO4. На границе раздела жидкостей появляется фиолетовое кольцо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в нуклеопротеидах.
4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10-ти каплям молибденового реактива (раствор молибдата аммония в азотной кислоте) добавить 5 капель гидролизата и кипятить смесь на пламени горелки. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонный цвет. После охлаждения в струе воды наблюдается появление желтого кристаллического осадка образовавшегося фосфомолибдата аммония.
Лабораторная работа 2. Определение концентрации мочевой кислоты
Переваривание нуклеопротеидов пищи начинается в желудке, где под действием пепсина и соляной кислоты они распадаются на полипептиды и нуклеиновые кислоты. Последние под влиянием ферментов тонкого кишечника гидролизуются сначала до мононуклеотидов, а затем до нуклеозидов и фосфорной кислоты. В кишечнике осуществляется всасывание, в основном, нуклеозидов, но возможен и дальнейший распад нуклеозидов до свободных азотистых оснований и пентоз, которые затем поступают в кровяное русло.
И нуклеозиды, и свободные азотистые основания могут частично использоваться для синтеза нуклеиновых кислот и нуклеотидов, однако поступление в организм с пищей азотистых оснований, по-видимому, не имеет решающего значения. Синтез нуклеиновых кислот определяется скоростью синтеза гетероциклических оснований de novo из низкомолекулярных азотистых и безазотистых предшественников: аспарагиновой кислоты и карбамоилфосфата – для пиримидиновых нуклеотидов, и активированной формы рибозы, глицина, глутамина, СО2, аспарагиновой кислоты и производных тетрагидрофолата – для пуриновых нуклеотидов.
В тканях, прежде всего в печени, свободные пуриновые основания как экзогенного, так и эндогенного происхождения подвергаются катаболизму с образованием мочевой кислоты – конечного продукта пуринового обмена у человека и большинства приматов, птиц и некоторых рептилий. Конечными продуктами распада пиримидинов являются СО2, аммиак (выводится в виде мочевины), -аланин и -аминоизомасляная кислота. Существует сложная система регуляции синтеза, повторного использования и распада азотистых оснований. Нарушения этих регуляторных механизмов особенно резко сказываются на обмене пуринов. Снижение биосинтеза пуринов вызывает ограничение роста и размножения клеток, тогда как усиленный распад пуринов до мочевой кислоты, которая обладает плохой растворимостью в воде, сопровождается ее отложением в суставах (подагра). В норме образующаяся в печени и тканях при окислении пуринов мочевая кислота поступает в кровь и затем через почки вместе с мочой выделяется из организма.
Принцип метода: мочевая кислота в щелочной среде восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив в краситель синего цвета. Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации мочевой кислоты в анализируемой пробе.
Материалы и реактивы:
1. Фосфорно-вольфрамовый реактив: Na2WO4 – (0,12 0,01) М,
H3PO4 – (0,47 0,05) М,
Li2SO4 – (0,29 0,02) М;
2. Кислота серная (0,35 0,02) М
3. Вольфрамат натрия (0,30 0,1) М
4. Калибровочный раствор мочевой кислоты (300 3) мкМ
или 0,05 г/л
5. Карбонат натрия
Образец: сыворотка крови, негемолизированная плазма крови; моча, разведенная дистиллированной водой в 10 раз.
Ход работы. Анализ проводится в соответствии со схемой, представленной в таблице.
Отмерить в кювету, мл |
Опытная проба |
Калибр. проба |
Холостая проба |
Дистиллированная вода |
4,0 |
4,0 |
4,5 |
Сыворотка (плазма), разбавленная моча |
0,5 |
– |
– |
Калибровочный раствор мочевой кислоты |
– |
0,5 |
– |
Кислота серная |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Вольфрамат натрия |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
Перемешать, выдержать 10 1 мин. при комнатной температуре (от +20 до +25 0С), центрифугировать 10 1 мин при 2000–5000 об/мин, отобрать необходимое количество центрифугата (вместо центрифугирования допускается фильтрование полученного раствора). | |||
Центрифугат (фильтрат) |
3,0 |
3,0 |
3,0 |
Раствор карбоната натрия |
1,5 |
1,5 |
1,5 |
Фосфорновольфрамовый реактив |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
Перемешать, выдержать 30 2 мин. при комнатной температуре (от +20 0С до +25 0С), измерить оптическую плотность опытной Епробы и калибровочной пробы Екалиб. против холостой в кюветах толщиной 10 мм при длине волны 650 нм. Окраска стабильна в течение 30 2 мин. |
Расчет результатов:
С (мкМ) = 300 Епробы /Екалибр. или
С (г/л) = 0,05 Епробы /Екалибр.
Для расчета концентрации мочевой кислоты в моче полученное значение (С) необходимо умножить на коэффициент разведения – 10.
Клинико-диагностическое значение. В норме с мочой у человека выделяется 1,60–3,54 ммоль/сутки (270–600 мг/сут) мочевой кислоты. Нормальная концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови составляет для мужчин 240–530 мкМ (0,05–0,06 г/л), для женщин на 25 % меньше – 185–440 мкМ (0,04–0,05 г/л).
Концентрация мочевой кислоты в крови увеличивается при тяжелой мышечной работе, приеме пищи, богатой нуклеопротеидами, а также при лейкемии, анемии и ряде других заболеваний.
При подагре (отложение в тканях кристаллов уратов, вызванное врождёнными энзимопатиями) наблюдается особенно резкое увеличение концентрации мочевой кислоты в крови, концентрация ее может повышаться до 0,2 г/л и более. Кристаллы уратов приводят к высвобождению в экстрацеллюлярное пространство как цитоплазматических, так и лизосомальных ферментов; в тканях развивается асептическое воспаление.
Для лечения подагры используют препараты, тормозящие образование мочевой кислоты (аллопуринол) или стимулирующие их выведение почками (антуран, цинхофен, атофан).
Уменьшение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови наблюдают при болезни Коновалова–Вильсона, некоторых злокачественных новообразованиях, употреблении таких препаратов, как салицилаты, пиперазин, атофан, кортикотропин.
Контрольные вопросы по теме «Основы молекулярной биологии»:
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды – составляющие компоненты молекул нуклеиновых кислот. Минорные азотистые основания и нуклеотиды.
Свободные нуклеотиды (АТФ, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, ЦТФ, УТФ, 3’,5’-АМФ, 3’,5’-ГМФ) и их биохимические функции.
Нуклеиновые кислоты. Общая характеристика ДНК и РНК, их биологическое значение в сохранении и передаче генетической информации.
Особенности первичной структуры ДНК и РНК. Связи, которые стабилизируют первичную структуру нуклеиновых кислот.
Вторичная структура ДНК, роль водородных связей в ее образовании (правила Чаргаффа, модель Уотсона–Крика), антипараллельность цепей.
Третичная структура ДНК. Физико-химические свойства ДНК: взаимодействие ДНК с катионными лигандами, образование нуклеосом.
Молекулярная организация ядерного хроматина эукариотов: нуклеосомная организация; гистоновые и негистоновые белки.
Строение, свойства и биологические функции РНК. Типы РНК: мРНК, тРНК, рРНК. Особенности структурной организации различных типов РНК.
Нуклеопротеиды: строение, биологические функции.
Биосинтез пуриновых нуклеотидов: схема реакций синтеза ИМФ; образование АМФ и ГМФ; механизмы регуляции.
Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов: схема реакций, регуляция синтеза.
Биосинтез дезоксирибонуклеотидов. Образование тимидиновых нуклеотидов, ингибиторы биосинтеза дТМФ как противоопухолевые средства.
Катаболизм пуриновых нуклеотидов; наследственные нарушения обмена мочевой кислоты.
Схема катаболизма пиримидиновых нуклеотидов.
Репликация ДНК: биологическое значение; полуконсервативный механизм репликации.
Последовательность этапов и ферменты репликации ДНК у прокариотов и эукариотов.
Транскрипция: РНК-полимеразы прокариотов и эукариотов, сигналы транскрипции (промоторные, инициаторные и терминальные участки генома).
Процессинг – посттранскрипционная модификация синтезированных мРНК.
Генетический (биологический) код; триплетная структура кода, его свойства.
Транспортные РНК и активация аминокислот. Аминоацил-тРНК-синтетаза.
Этапы и механизмы трансляции (биосинтеза белка) в рибосомах: инициация, элонгация и терминация. Процессинг.
Контрольные вопросы по теме «Основы молекулярной генетики»:
Посттрансляционная модификация пептидных цепей. Регуляция трансляции.
Ингибиторы транскрипции и трансляции у прокариотов и эукариотов: антибиотики и интерфероны – их применение в медицине; дифтерийный токсин.
Регуляция экспрессии генов прокариотов: регуляторные и структурные участки лактазного (Lac-) оперона (регуляторный ген, промотор, оператор).
Мутации: геномные, хромосомные, генные; механизмы действия мутагенов; роль индуцированных мутаций в возникновении энзимопатий и наследственных болезней человека.
Биологическое значение и механизмы репарации ДНК. Репарация УФ-индуктированных генных мутаций: пигментная ксеродерма.
Генная инженерия: конструирование рекомбинантных ДНК; клонирование генов; генно-инженерный синтез ферментов, гормонов, интерферонов и др.