Учебник

коллагена – для диагностики метаболических заболеваний костной ткани,

прокальцитонина и пресепсин – для диагностики сепсиса.

Миоглобин. Миоглобин (МГ) – гемсодержащий белок с молекулярной массой 17,3 кДа. МГ является одним из ключевых соединений,

определяющих интенсивность окислительного метаболизма в скелетной мышце и, особенно, в миокарде. Основная его функция – транспорт кислорода от гемоглобина, а также поддержание оптимального кислородного градиента вблизи митохондрий. МГ локализуется в разных участках миоцитов. Благодаря мобильности, отсутствию прочных связей с внутриклеточными структурами, а также небольшой молекулярной массе, он быстро выходит из миоцита при его повреждении, попадает в кровь, а затем выводится почками с мочой. Уровень МГ в крови практически здоровых людей не превышает 95 нг/мл. В норме почками выводится не более 4

мкг/сутки МГ (в среднем 2-4 нг/мл).

При ОИМ разрушаются мембраны кардиомиоцитов, содержимое клетки, в том числе и белки, поступают в кровь. МГ появляется в кровотоке через 2-4 часа после появления боли при ОИМ, степень повышения зависит от площади поражения миокарда. Это самый «короткоживущий» маркер ОИМ, так как активно выводится почками – его уровень приходит к норме,

как правило, за 24 часа. В этом заключается его уникальная диагностическая ценность. Если уровень МГ остается повышенным после острого приступа ИМ – это свидетельствует о расширении зоны инфаркта. Повторные повышения уровня МГ в крови на фоне уже начавшейся нормализации говорит об образовании новых некротических очагов. Таким образом, МГ важен для диагностики повторного ИМ.

Существенным недостатком этого маркера является его низкая специфичность – он появляется в крови при повреждении скелетных мышц.

При нарушении почечного кровотока и снижении фильтрации в почках уровень МГ в сыворотке крови может существенно повышаться.

501

Тропонины. Тропонины (Тн) – белки, участвующие в регуляции сокращения миофибрил. ТнI является ингибирующей субъединицей тропонинового комплекса, связывающей актин в период расслабления и тормозящей АТФ-азную активность актомиозина, предотвращая мышечное сокращение в отсутствие ионов кальция. ТнТ является регуляторной субъединицей, прикрепляющей тропониновый комплекс к тонким филаментам, тем самым он участвует в регулируемом Са акте сокращения.

ТнI и ТнТ существуют в трех изоформах, уникальных по структуре для каждого типа поперечно-полосатых мышц (быстрых, медленных и сердечных). Кардиальная изоформа ТнI существенно отличается от ТнI ,

находящейся в скелетной мускулатуре: он содержит дополнительный N-

терминальный полипептид, состоящий из тридцати одного аминокислотного остатка. Таким образом, ТнI – абсолютно специфичный миокардиальный протеин. Молекулярная масса ТнI – около 24 кДа.

В диагностике ОИМ используют сердечные изоформы как ТнI, так и ТнТ. Они могут быть выявлены среди аналогичных белков скелетных мышц иммунологически, с помощью моноклональных антител. Оба маркера (ТнI и

ТнТ) могут быть обнаружены в крови пациента спустя 3-6 часов после начала боли в груди, достигая пикового уровня в течение 12-36 часов (а иногда и позже), удерживаясь на повышенном уровне в течение нескольких суток.

Абсолютная специфичность для миокарда, быстрый подъем и длительная циркуляция в крови после ОИМ определили этот белок в качестве основного лабораторного маркера инфаркта миокарда.

Высокочувствительный тест на тропонин – новый уровень диагностики с использованием маркерных белков. Быстрый прогресс в исследованиях патогенеза заболеваний сердца и сосудов сопровождается сменой набора лабораторных тестов, особенно это касается инфаркта миокарда и предшествующих ему патологических изменений. После открытия сердечных тропонинов Т и I и создания диагностикумов для их определения казалось, что проблемы с лабораторными методами диагностики инфаркта

502

миокарда решены. Однако стремление получить лабораторное заключение как можно раньше и дифференцировать приступ стенокардии от инфаркта миокарда стало основанием для разработки тестов высокочувствительного определения тропонинов. Эти тесты, основанные на многократном усилении сигналов взаимодействия антител со специфичными эпитопами тропонинов,

оказались настолько чувствительными, что традиционная схема иммунохимического анализа с использованием калибраторов контрольных сывороток и особенно наработкой референтных диапазонов оказалась негодной для этих тестов.

Для тестов высокочувствительного тропонина предложен новый алгоритм: оценка аналитических характеристик теста по способности определять содержание наноколичеств аналита у здоровых людей и диагностика некроза миокарда по динамке изменения за несколько часов.

Кроме того, оказалось, что этот тест способен дать информацию о степени повреждения сердечной мышцы, в том числе неишемической этиологии.

Тест оказался широко востребованным для дифференциальной диагностики заболеваний сердца в кардиологической, хирургической, инфекционной и

циркулирующих тропонинов. С помощью этих методов установлено, что у здоровых людей существуют нормальные уровни тропонинов, которые составляют 1-5 нанограммов на литр.

Международные исследования показали, что измерение динамики повышения высокочувствительных тропонинов в течение 2-3 часов после поступления с признаками ОКС выявляет значительно большее количество случаев инфаркта миокарда, чем обычные тропониновые тесты. При этом высокочувствительные тропонины переквалифицируют большое количество случаев, ранее считавшихся нестабильной стенокардией, в диагноз инфаркт миокарда без поъема ST интервала (ИМБST) на ЭКГ. Это, в свою очередь,

при проведении адекватных вмешательств снижает количество

503

неблагоприятных исходов (повторные ИМ, летальность) почти в два раза.

Этот факт явился одной из причин сформулированного положения: Для всех пациентов, у которых подозревается ИМБST, обязательным является измерение биомаркеров повреждения кардиомиоцитов, предпочтительным является количественное измерение высокочувствительного тропонина.

Мозговой натрийуретический пептид. Мозговой (В-типа)

натрийуретический пептид (BNP) и его аминотерминальный фрагмент

(NTproBNP) являются основными лабораторными маркерами в клинической практике сердечной недостаточности (СН). Секретируется BNP миоцитами желудочков сердца в ответ на повышение напряжения миокарда при увеличении давления или объема крови в левом желудочке сердца, а также при механическом растяжении сердечной мышцы. Свое название BNP

получил в связи с тем, что впервые был обнаружен в мозге свиньи и только впоследствии был выделен из сердца. В плазме крови BNP находится в виде нескольких форм про-гормонов (proBNP), имеющих различные свойства и биологическую активность, при расщеплении которых образуются активные пептиды. Для целей диагностики определение proBNP (физиологически неактивный терминальный участок гормона) оказалось более эффективным,

чем определение BNP, так как proBNP имеет более продолжительный период полувыведения (proBNP 60-120 мин, BNP – 20 мин). Кроме того, proBNP

обладает высокой стабильностью в сыворотке и плазме крови, его уровень не подвержен циркадным ритмам, не зависит от положения пациента при взятии и не требует специальной подготовки пробы.

Терминальные пептиды коллагена. Каpбокси- и аминотеpминальные телопептиды коллагена I типа (КТТКI, АТТКI) образуются в тканях, которые содержат коллаген I типа. Молекулярная масса телопептидов составляет от 9

до 20 кД, они эффективно выводятся с мочой. Концентрация КТТКI и АТТКI

в сыворотке тесно коррелирует со скоростью резорбции кости. Для определения АТТКI используют иммуноферментный анализ с моноклональными антителами против поперечносвязанных молекул

504

коллагена I типа (CrossLaps). CrossLaps можно использовать для определения теллопептидов коллагена как в сыворотке, так и в моче. В период менопаузы маркер CrossLaps увеличивается в сыворотке почти в 2 раза. Динамическое определение уровня телопептидов имеет важное значение для прогнозирования восстановления минеральной плотности кости при проведении антирезорбционной терапии у женщин в постменопаузальный период, у пациентов с остеопенией и полезнью Педжета. Преимущество использования CrossLaps состоит в том, что данный маркер костной резорбции позволяет быстро оценить эффективность всех видов терапии остеопороза уже через 3 месяца после начала лечения.Увеличение CrossLaps

от среднего значения нормы на 2SD ассоциируется с 2-х кратным повышением риска переломом шейки бедра.

Прокальцитонин. Прокальцитонин является прогормоном кальцитонина. При тяжелой системной инфекции прокальцитонин продуцируется тканями вне щитовидной железы. У пациентов, которые предварительно подверглись тотальной тиреоидектомии, все равно продуцируются высокие уровни прокальцитонина при тяжелой инфекции.

Предполагают, что прокальцитонин вносит вклад в нежелательные эффекты системной воспалительной реакции. У здоровых лиц концентрация ПКТ в плазме ниже 0,05 нг/мл, у пациентов с тяжелым сепсисом или септическим шоком она может вырасти до 1000 нг/мл.

Повышенный уровень ПКТ указывает на бактериальную инфекцию,

сопровождающуюся системной воспалительной реакцией. Локализованная инфекция обычно не приводит к увеличению концентрации ПКТ в крови.

Одно из главных преимуществ ПКТ состоит в его раннем и высокоспецифичном увеличении в ответ на тяжелые системные бактериальные инфекции и сепсис. При развитии сепсиса можно наблюдать увеличение уровней ПКТ через 3-6 часов после развития инфекции. Уровень ПКТ обычно остается низким при вирусных инфекциях, хронических воспалительных расстройствах или аутоиммунных процессах. ПКТ дает

505

возможность провести дифференциальную диагностику между упомянутыми выше клиническими состояниями и тяжелой бактериальной инфекцией

(сепсисом). Низкое значение ПКТ автоматически не исключает бактериальной инфекции, т.к. может иметь место на ранней стадии течения инфекций, при локализованных инфекциях и при подостром эндокардите.

Пресепсин. Пресепсин (ПСП) — это фрагмент, образуемый из растворимой формы мембранного гликопротеина, который находится на поверхности моноцитов, макрофагов и нейтрофилов. Растворимый гликопротеиновый рецептор индуцирует активацию неспецифического иммунитета после взаимодействия с компонентами бактерий и грибов. При инфекции после отщепления от клеточной поверхности и активации фагоцитоза он расщепляется лизосомальными и бактериальными протеиназами с образованием N-терминального пептида с молекулярной массой 13 Кда, который и был назван пресепсином. При инфекции ПСП повышается через 2 ч после ее начала (раньше, чем ИЛ-6, ПКТ и СРБ),

достигает пиковых концентраций через 3 ч и снижается через 4-8 ч. ПСП повышается при системных инфекциях, вызываемых бактериальными и грибковыми патогенами. При вирусных инфекциях ПСП не повышается.

5.2.Лабораторная энзимология

5.2.1.Структура ихарактеристика ферментов

Структура ферментов. Ферменты или энзимы – это белки,

обладающие каталитической активностью и ускоряющие протекание реакций обмена веществ. Активный центр фермента представляет собой участок белковой молекулы, в образовании которого участвуют радикалы ряда аминокислот, определенным образом ориентированных в пространстве.

Некоторые из них принимают участие в связывании субстрата, а другие - в

химическом превращении субстрата в продукт реакции. В составе полипептидной цепи большинство этих радикалов удалены друг от друга, их пространственное сближение происходит благодаря скручиванию

506

полипептидной цепи. В активном центре различают каталитический участок,

непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и «контактную» (якорную) площадку, обеспечивающую связывание субстрата и формирование фермент-субстратного комплекса. В свою очередь молекула субстрата содержит различные участки и связи, подвергающиеся атаке со стороны фермента и несколько участков, избирательно связываемые ферментом. Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать еще один центр (центры), не выполняющий каталитическую функцию, но служащий для присоединения своего лиганда. Он назван аллостерическим.

Активность многих ферментов проявляется только в присутствии небелковых веществ, называемых кофакторами, например Са2+ Zn2+, Mg2+ ,

Мn2+ , Fe2+ , Сu2+ , К+ , Na+ . Молекулярный комплекс белка и кофактора обладает максимальной каталитической активностью. Белковый компонент,

лишенный кофактора, называется апоферментом; он подчас обладает низкой активностью, а часто вообще неактивен. Если кофактор представлен органическим компонентом, то его называют коферментом. Большая часть коферментов образуется из витаминов (B1, B2, B6, пантотеновая кислота) или представляет собой их производные.

Кинетика ферментативных реакций. Ферменты, как биокатализаторы, обладают уникально высокой каталитической активностью. Добавка незначительных количеств фермента приводит к ускорению реакции во много тысяч раз.

В основу теории действия ферментов и ферментативной кинетики положены представления Михаэлиса и Ментен о том, что фермент Е реагирует с субстратом S, образуя фермент-субстратный комплекс ES,

который распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Реакция перехода субстрата в продукт (S Р ) протекает потому, что некоторая доля молекул субстрата обладает энергией, которой достаточно для перехода в активированное состояние, в котором появляется возможность образования

507

новой химической связи, ведущей к образованию продукта. Количество энергии, необходимое для перехода 1 моля вещества в активированное состояние, называется энергией активации. Катализаторы, в том числе ферменты, не меняют суммарную реакцию, а ускоряют ее путем снижения свободной энергии активации за счет образования фермент-субстратного комплекса. Сорбция субстрата на ферменте, протекающая при участии функциональных групп белка и молекулы субстрата, обусловлена гидрофобными, полярными или ионными взаимодействиями. В реальных условиях ни субстрат, ни фермент не являются жесткими структурами,

поэтому оба при связывании претерпевают конформационные изменения,

что существенно снижает барьер свободной энергии активации последующей химической реакции.

Скорость химических, в том числе и ферментативных реакций,

определяется рядом факторов:

Химической природой реагирующих веществ (для ферментативной реакции имеет значение сродство фермента к субстрату). Для многих ферментов скорость реакции определяется природой субстрата.

Концентрацией реагирующих веществ (для ферментативной реакции

–концентрацией субстрата и фермента).

Условиями протекания реакции – температурой, величиной рН,

присутствием активаторов, ингибиторов и т.д.

Химические реакции можно классифицировать на основе кинетических характеристик, в частности, исходя из порядка реакции. Различают реакции нулевого, первого, второго и т.д. порядка в зависимости от того, как скорость реакции зависит от концентрации реагирующих веществ. Основное значение для клинической биохимии имеют типы реакций, катализируемых ферментами реакции нулевого и 1-го порядка. К реакциям нулевого порядка относят такие реакции, в которых скорость ферментативной реакции постоянна и не зависит от концентрации субстрата. Реакции первого порядка

характеризуются тем, что скорость реакции в каждый момент времени

508

определяется концентрацией субстрата. В этом случае скорость реакции меняется в зависимости от истощения субстрата. В условиях насыщения фермента субстратом в начальные промежутки времени, когда превращению подверглась незначительная часть субстрата, реакцию можно отнести к реакции нулевого порядка. Общий подход к определению активности ферментов в клинической биохимии состоит в определении скорости реакции при достаточно высокой концентрации субстрата.

Специфичность действия ферментов. Важное свойство ферментов – избирательность (специфичность) в отношении структуры субстрата, что обеспечивает строгую упорядоченность и тесную взаимосвязь между отдельными ферментативными реакциями. Причина субстратной специфичности кроется в уникальной структуре фермента. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, каждый такой фермент катализирует единственную реакцию. К таким ферментам относится уреаза,

катализирующая расщепление мочевины до аммиака и оксида углерода. К

ферментам с высокой субстратной специфичностью можно отнести глюкозоксидазу, катализирующую превращение D-глюкозы в глюконовую кислоту.

Однако многие ферменты обладают лишь относительной субстратной специфичностью. Они способны катализировать один тип реакции с более чем одним структурно-подобным субстратом. Существует группа ферментов,

обладающих групповой специфичностью и способных к превращению ряда субстратов, в структуре которых присутствуют определенные группировки.

В частности, пепсин гидролизует пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами. Ряд ферментов проявляет специфичность к определенным типам реакций, например к переносу различных групп,

гидролизу.

Некоторые ферменты проявляют стереоспецифичность, катализируя превращения только одной стереохимической формы субстрата. В организме человека претерпевают превращения только L-формы аминокислот, D-

509

формы углеводов. Фермент лактатдегидрогеназа катализирует превращение

L-молочной кислоты в пировиноградную.

Классификация ферментов. Типы катализируемых реакций. В

основу классификации ферментов положен тип катализируемой химической реакции в сочетании с названием субстрата. Согласно этой классификации ферменты делят на шесть классов (табл. 5.14).

На основании данной системы Международная комиссия подготовила Классификацию ферментов (КФ) с включением списка ферментов. В списке для каждого фермента, помимо номера (шифра), приводятся систематическое

(рациональное) название, рекомендуемое (рабочее) название. Кроме того,

указана химическая реакция, которую катализирует данный фермент, а также примечания о специфичности действия.

Шифр каждого фермента содержит четыре цифры, разделенные точками, и составляется по следующему принципу. Первая цифра указывает номер одного из шести классов ферментов. Вторая цифра означает подкласс,

510