Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

ГЛАВА 5 ОПТИМИЗАЦИЯ МАЗЕВОЙ КОМПОЗИЦИИ

ÑИНТЕРФЕРОНОМ

Âтерапии вирусных заболеваний ИФН находит все более широкое применение. Глубокое научное изучение свойств этого лимфокина позволило довольно четко выделить ряд патологий, при которых использование ИФН оправданно и высокоэффективно. Очевиден тот факт, что препараты ЧЛИ высокоэффективны при таких нозологических формах герпетических заболеваний, как кератит, лабиальный герпес, генитальный герпес, ветрянная оспа, опоясывающий лишай [12]. С появлением генноинженерных препаратов человеческого ИФН, имеющих более высокую активность, нежели

óприродных ИФН (даже концентрированных), клиническое применение их значительно расширилось [74].

Âто же время результаты многочисленных научных и клинических исследований показали, что инъекционная терапия высокими дозами рекомбинантного ИФН сопровождается рядом побочных эффектов и требует постоянного контроля за картиной крови пациента. Препараты генноинженерного ИФН в отличие от природного лишены сопутствующих лимфокинов, которые обуславливают многообразие эффектов ЧЛИ и сбалансированность воздействия, например, фактора, стимулирующего фагоцитоз, универсального регулятора иммунитета ИЛ-1, фактора некроза опухолей. Кроме того, было показано, что в отличие от рекомбинантного природный ЧЛИ может быть клинически эффективен даже в низких дозах 1000–4000 МЕ/мл при лечении лабиального и генитального герпеса.

Основная лекарственная форма при лечении герпетических кожных заболеваний – мазь. Однако до настоящего времени неизвестны технологии изготовления мазей, содержащих в качестве активного вещества человече- ский лейкоцитарный интерферон. В связи с этим нами предприняты исследования по разработке мягкой лекарственной формы для наружного применения – мази с лейкоцитарным человеческим интерфероном.

83

5.1. Сравнительная оценка различных мазевых композиций и отработка технологии приготовления мази с интерфероном

При разработке мази с ИФН мы уделяли большое внимание выбору оптимального состава мазевой основы. Мазевая основа должна обеспе- чивать максимальное терапевтическое действие входящего в е¸ состав лекарственного вещества.

Первые попытки создания мазей с ИФН оказались не совсем удач- ными, что было связано с использованием гидрофобных мазевых основ, в частности кашалотового жира, силиконовой основы, безводного ланолина. Мазевые композиции ИФН на указанных основах оказывали хорошее терапевтическое действие, но, поскольку в процессе хранения активность ИФН снижалась, эти мази рекомендовали готовить ex tempore.

Кроме того, жировые основы затрудняли анализ активности лекарственной формы из-за сложности экстрагирования ИФН, а главное, ограничивали всасывание лимфокина, поскольку контакт с действующим на- чалом происходил только на границе соприкосновения. Это обусловливало необходимость введения в основу высокоактивного ИФН для обеспечения лечебного эффекта препарата. Перечисленные недостатки мазевой формы ИФН были успешно преодолены зарубежными исследователями, которые в качестве основы использовали водорастворимые высокомолекулярные соединения, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) и метилцеллюлозу. Однако названные основы имеют и теневые стороны. Так, ПЭГ в силу сильных водоотнимающих свойств обладает в некоторой степени раздражающим действием на кожу, а метилцеллюлоза имеет ограничения по совместимости с рядом химических соединений.

Характерной особенностью гидрофильных основ является способность растворяться в воде или смешиваться с ней. В эту группу основ входят гели высокомолекулярных углеводов и белков, синтетических, неорганических веществ. Недостатком водосодержащих гидрофильных основ является малая устойчивость к микробной контаминации.

Липофильно-гидрофильные, или дифильные основы – это различные по составу искусственно созданные композиции, обладающие как липофильными, так и гидрофильными свойствами. Дифильные основы в отли- чие от углеводородов обеспечивают высокую резорбцию лекарственных веществ из мазей, не препятствуют газо- и теплообмену кожных покровов, поддерживают ее водный баланс, обладают хорошими консистентными

84

свойствами. В качестве обязательного компонента в их состав входят по- верхностно-активные вещества – ПАВ. Одна из разновидностей дифильных мазей – эмульсионная: масло/вода è вода/масло. Эмульсионные мазевые основы представляют большой интерес благодаря способности резко усиливать резорбцию кожей лекарственных веществ, входящих в состав мазей. Это объясняется наличием в их основе ПАВ. Кроме того, эмульгированная водная фаза при втирании внедряется в выводные протоки сальных и потовых желез, что облегчает всасывание. Мази на эмульсионных основах характеризуются малой вязкостью и невысокими адгезионными свойствами, легко наносятся на кожу и слизистые покровы.

Для создания мази с ЧЛИ нами опробованы основы как гидрофильного, так и гидрофобного и эмульсионного свойства, разрешенные к медицинскому применению. Всего изучено 10 вариантов мазевых основ. В табл. 18 представлены результаты сравнительной оценки вариантов мази с ИФН, приготовленной на различных мазевых основах, с позиции сохранения физических свойств и специфической активности. Как следует из данных табл. 22, наиболее рациональными основами являются эмульсионные, в состав которых входят поверхностно-ак- тивные вещества: МГД и Т-2 (варианты 5,6,7). По нашим данным, в ка- честве гидрофобной основы целесообразно использовать вазелин или ланолин, которые в химическом отношении очень устойчивы и индифферентны, не раздражают кожу и слизистые оболочки, и поэтому широко применяются для мазей, являясь стандартными мазевыми основами. Однако ланолин затрудняет выделение специфической активности ИФН из мази.

Ò à á ë è ö à 1 8

Сравнительная оценка физических свойств и специфической активности мази с интерфероном, приготовленной на различных мазевых основах, в различных условиях хранения

85

Î ê î í ÷ à í è å ò à á ë . 1 8

Примечание. Состав ¹ 1,2 – гидрофильные основы; состав ¹ 3,4 – липофильные основы;

состав ¹ 5–10 – дифильные эмульсионные основы.

МГД – условное название моноглицеридов дистиллированных, представляющих собой моноэфиры глицерина и высших жирных кислот. Эмульгатор Т-2 – продукт этерификации стеариновой кислоты триглицеридом (дистеарат триглицерид), представляющий собой твердую, воскообразную массу желтого или светло-коричневого цвета с запахом стеарина. Использованные в основе два ПАВ улучшают структу-

86

ру мази, а также способствуют лучшему распределению ее на поверхности кожи или слизистых оболочек, в результате чего обеспечивается высокая эффективность всасывания.

Следующим этапом наших исследований являлось определение оптимального соотношения компонентов эмульсионной основы. Варианты количественного соотношения составляющих мазевых композиций представлены в табл. 19.

Приготовленные композиционные варианты основы оценивали по следующим показателям: рН, устойчивость при центрифугировании и термостатировании в различных условиях (табл. 20).

Ò à á ë è ö à 2 0

Оценка физико-химических свойств различных композиций мазевых основ

87

Î ê î í ÷ à í è å ò à á ë . 2 0

Примечание. Количественное соотношение составляющих мазевых основ указано в соот-

ветствии с порядковым номером (см. табл. 19).

Как видно из данных, представленных в табл. 20, значения рН всех мазевых композиций варьируют от 6,1 до 6,8 , что соответствует рН кожи

èслизистых оболочек. При этом расслоения при центрифугировании

èтермостатировании у изучаемых вариантов основ не отмечается. Основы с содержанием ПВА менее 10 % имели жидкую консистенцию, более 10 % – жесткую структуру.

Исходя из полученных данных, за основу была принята оптимальная мазевая композиция следующего состава, г: вазелин 60,0; МГД 2,0–5,0; эмульгатор (Т-2) 2,0–5,0; дистиллированная вода до 30,0.

Новизна предложенного состава мазевой композиции «Мазь с интерфероном человеческим лейкоцитарным» защищена Патентом на изобретение РФ ¹ 2141819, приоритет от 15.07.1997.

Следующим этапом явились исследования, направленные на определение способа экстрагирования ИФН из мазевой основы для проведения контроля противовирусной активности лекарственной формы ИФН.

88

5.2. Разработка методики определения противовирусной активности интерферона в дифильных мазевых основах

Известен способ определения противовирусной активности интерферона из мази, включающий обработку е¸ липазой с последующим определением противовирусной активности ИФН путем титрования на клеточных культурах, чувствительных к интерферону. Недостатком данного способа является низкая чувствительность и высокая стоимость метода. Существует также способ, в соответствии с которым экстрагирование ИФН проводят эфиром для наркоза, а определение активного нача- ла осуществляют в жидкой фазе. Отрицательной стороной последнего способа является малый процент выхода ИФН из мази.

Цель настоящих исследований – разработка универсального способа экстрагирования ИФН из дифильных мазевых основ, содержащих его в качестве активного специфического начала. В связи с этим нами изучен широкий спектр растворителей: водные – 0,9% раствор хлорида натрия рН 7,2; вода очищенная; среда 199; органические – эфир, н-гексан; которые мы использовали для экстрагирования ИФН из липофильных основ.

В табл. 21 представлены результаты сравнения исходной (расчетной) и фактической противовирусной активности ИНФ, экстрагируемой из дифильной основы (на примере 5 серий). Полученные данные показали, что наименьшее количество ИФН экстрагировалось из дифильных основ с помощью эфира или н-гексана (р < 0,001), растворение в очищенной воде также не способствует полному выходу ЧЛИ (р<0,05). Статистически достоверных отличий при экстрагированиии 0,9% раствором хлорида натрия (р < 0,5), по сравнению с питательной средой 199 не отмечали.

Как видно из табл. 22, органические растворители не обеспечивают достижения достаточно полного экстрагирования целевого продукта из дифильных основ. Так, сочетанное использование н-гексана и 0,9% раствора натрия хлорида (NaCl) обеспечивает лишь 25% извлечение ИФН, а экстрагирование эфиром –75% при 15-минутном воздействии с постепенным снижением при 120 мин экспозиции до 10 и 60% соответственно. Использование водных растворов, таких как вода очищенная, 0,9% раствор натрия хлорида и среда 199, уже через 15–20 мин позволяет экстрагировать до 100% исходной активности ИФН из мазевой основы. Следует отметить, что использование воды очищенной в качестве экстрагента ИФН из мазевой основы снижает уровень исходной активности ИФН че-

89

рез 30 мин с момента экстрагирования. Полученный результат ещ¸ раз подтверждает известный факт гидрофобности ИФН. Учитывая стоимость среды 199, в качестве альтернативного нами был принят экстрагент – 0,9% раствор натрия хлорида. Способ экстрагирования ИФН из дифильных мазевых основ защищен Патентом на изобретение РФ ¹ 2148396, приоритет от 25.08.1998.

Ò à á ë è ö à 2 1

Оценка эффективности экстрагирования ИФН из мазевой основы препарата с помощью различных растворителей

Ò à á ë è ö à 2 2

Выход активного вещества в зависимости от времени экстрагирования ИФН из мазевой дифильной основы

90