Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

Результаты изучения влияния используемых технологических методов на возможность индикации цитокинов в препарате представлены в табл. 13. Нами изучены 4 варианта природного ИФН, синтезированного донорскими лейкоцитами в ответ на индукцию вирусом Сендай: 1 группа – жидкий ИФН, полученный сразу после синтеза ЧЛИ; 2-я группа – лиофильно высушенный ИФН первой группы; 3-я группа – жидкий очищенный методом гельфильтрации ЧЛИ; 4-я группа – лиофильно высушенный ИФН третьей группы. Проведенный сравнительный анализ показывает, что в процессе лиофильной сушки нативного ИФН, а также при последующей очистке ИФН от низкомолекулярных соединений и затем в лиофилизированных образцах очищенного ИФН достоверно увеличивается количество ИЛ-4.

Ò à á ë è ö à 1 3

Сравнительный анализ содержания цитокина ИЛ-4 в препаратах ЧЛИ, полученного на различных стадиях технологического процесса

* –р <0,05; ** –р <0,005 по отношению жидкому нативному препарату ИФН.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что предложенная нами технология приготовления ЧЛИ позволяет полу- чать препараты ИФН, содержащие различный спектр и уровень цитокинов в зависимости от степени очистки интерферона. Созданная нами унифицированная технология отличается от регламентированной тем, что использование очищенного и концентрированного вируса Сендай в качестве интерфероногена способствует синтезу донорскими лейкоцитами ЧЛИ с удельной противовирусной активностью в 1,37 раза выше, чем по регламентированной технологии. Синтезированный по предложенно-

51

му нами методу ИФН в дальнейшем был использован в качестве активной субстанции для приготовления новых лекарственных форм ЧЛИ.

Контрольные вопросы к главе 2

1.Каковы оптимальные условия культивирования вируса Сендай

âусловиях крупномасштабного производства?

2.Какой метод позволяет получить наибольшее количество виру- са-интерфероногена?

3.В чем суть реакторного метода культивирования вирусиндуцированных лейкоцитов?

4.Объясните суть технологической схемы получения природного

-интерферона?

5.Какие требования предъявляются к условиям синтеза интерферона, направленного на присутствие различного спектра цитокинов?

6.Каковы основные параметры синтеза интерферона, позволяющие получать максимальное количество полуфабриката?

52

ГЛАВА 3

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА,

АСПЕКТЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Как уже указывалось ранее (разд. 1), иммунобиологические свойства препаратов ИФН имеют ряд преимуществ по сравнению с другими противовирусными средствами [49]. Их отличает широкий спектр действия, возможность назначения лечения при вирусных инфекциях без идентификации вируса и позитивное действие уже на ранних этапах инфекции. При использовании ИФН отсутствует выраженное токсическое действие при местном использовании, а в дозах, близких к физиологиче- ским, и при системном введении.

Исторически сложилось так, что в силу большей доступности лейкоцитов для получения ИФН, более хорошо изученными оказались иммунобиологические свойства и клинические аспекты применения ИФНлейкоцитарного происхождения. Именно этот вид ИФН как природный, так и рекомбинантный в настоящее время наиболее широко применяется в терапевтических целях. Семейство ИФНсодержит около 20 подтипов, поэтому природные препараты – «Интерферон человеческий лейкоцитарный», «Эгиферон», «Вэлферон» – многокомпонентны и содержат большинство подтипов.

Рекомбинантные ИФНявляются продуктами одного реконструированного гена, поэтому всегда однокомпонентны, что может снижать потенциал терапевтической активности указанного препарата. Кроме того, природные ИФН не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном многократном введении. Некоторые рекомбинантные ИФН, напротив, при введении инъекционным путем могут вызывать образование нейтрализующих или

55

связывающих антител [45,47], и в ряде случаев их применение приводит к осложнениям [100].

Наиболее часто используют рекомбинантные ИФН- 2 (реаферон, роферон), ИФН- 2 (интрон А, реальдирон) и ИФН- 2ñ (берофор), являющиеся аналогами природных подтипов с точечными мутациями в белковой структуре, соответствующей позициям аминокислот ли- зин-гистидин, аргинин-гистидин, аргинин-аргинин, мало влияющими на активность ИФН, но являющимися существенными с точки зрения сенсибилизации. Установлено, что при индукции вирусом Сендай лейкоциты продуцируют главным образом ИФН- 2 è ÈÔÍ- 2ñ. При этом практически отсутствует подтип ИФН- 2 . Следовательно, для человеческой популяции характерны подтипы ИФН- 2 è ÈÔÍ- 2ñ, поэтому препараты ИФН- 2 имеют больший риск вызвать сенсибилизацию и образование антител, которые в высоких титрах будут снижать их терапевтиче- ский потенциал. Уровень антител в крови больных должен контролироваться при длительном лечении рекомбинантными ИФН. При обнаружении антител целесообразен переход на использование природных ИФН. При местном применении ИФНне было отмечено образования специфических антител к препарату.

ИФНпродуцируется главным образом клетками кожно-мышеч- ной ткани. В общем пуле синтезируемого ИФН вирус-индуцированными лейкоцитами около 10% составляет ИФН-. Этот вид ИФН имеет выраженный тропизм к кожно-мышечной ткани, поэтому при в/м введении задерживается в месте инъекции. Эффект фармакологического действия при внутривенном введении ИФНмало отличается от ИФН-. Крупнейшим производителем природного ИФНявляется японская фирма Torei Indasnris, выпускающая его под названием «Ферон». Разработан и рекомбинантный препарат ИФН-, выпускаемый фирмой Ages-Seropo (Швейцария), который под названием «Ребиф» зарегистрирован на российском рынке.

Для стабилизации активности в структуре рекомбинантного ИФНвведена замена одного аминокислотного остатка, включающего цистеин, на серин в положении 17 (ИФН- ser). При этом риск развития сенсибилизации значительно увеличился. Предприятием Triron , объединяющим 2 калифорнийские компании, начато производство бета-рекомби- нантного человеческого ИФН (Betaseron ®), который успешно прошел

56

клинические испытания эффективности в лечении меланомы, лейкоза, гепатита В, генитальных бородавок и др. При этих заболеваниях использование препарата дало обнадеживающие результаты, причем наиболее выраженные данные были отмечены при применении в комбинации его с рекомбинантным интерлейкином 2-пролейкином.

Высокие дозы ИФНшироко используют в качестве средства лече- ния некоторых клинических форм рассеянного склероза. По данным оте- чественных исследователей, природный ИФНтакже достаточно эффективен при указанной патологии. Этого следовало ожидать, исходя из аналогичности их фармакологических свойств. Кроме того, имеются данные об использовании ИФНкак в виде мази для лечения рецидивирующего герпеса лица, так и инъекций при лечении хронического гепатита, патологии легких, папилломавирусных инфекций.

ИФНпродуцируют только дифференцированные Тh1 (Т-хелпер- ные лимфоциты I типа) и ЕК (естественные киллерные клетки). Индукторами ИФНявляются митогены Т-лимфоцитов (ФГА-р, КонА), опухолевые антигены для ЕК. Кинетика его продукции несколько замедлена по сравнению с продукцией ИФН-. Подавление выработки ИФН-, которое наблюдается практически при любой патологии, сопровождается глубоким снижением клеточных реакций иммунитета, в частности фагоцитарной функции макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов, цитолитической активности естественных киллеров (ЕК) и Т-лимфоцитов, ГЗТ,

èактивизацией аллергических реакций.

Â1986 году международные компании США (Biogen, baxter-Travenol), Швецарии (Ciba Geigy), Японии (Kyowa Hakko), производящие препараты

человеческого иммунного ИФН-, начали проведение расширенных клини- ческих испытаний этих препаратов при лечении рака. В России до настоящего времени не зарегистрировано лекарственной формы ИФН-. В связи с этим, естественно, крайне ограничен и опыт его клинического применения

âнашей стране.

3.1.Жидкие лекарственные формы природного

интерферона

Большое разнообразие лекарственных форм ИФН- очень важно для медицинской практики, так как позволяет варьировать назначение тех или иных препаратов ИФН применительно к специфике заболевания

57

больного. При этом должно учитываться, что местное применение, когда оно возможно, всегда целесообразнее системного. Кроме того, местное применение редко сопровождается нежелательными эффектами, такими как образование специфических антител на введение препарата, депрессионное влияние на гемопоэз. Препараты ИФН местного применения позволяют локально или внутриорганно влиять на патологический процесс, но при этом мало влияют на кроветворение. Вместе с тем при иммунодефицитных состояниях чаще требуется проведение комплексного лечения, поэтому в терапевтических схемах более перспективно сочетание местного и системного применения ИФН [64].

Первая лекарственная форма ИФНбыла разработана в 1967 году академиком АМН СССР В.Д. Соловьевым и соавторами и впервые в мире в 1969 году была официально разрешена МЗ СССР для массового применения в качестве средства профилактики и лечения гриппа. С этого времени в России была открыта новая страница в лечении инфекций интерфероном, и прежде всего вирусных. Долгое время отношение к ИФН как к лекарственному средству было крайне осторожным. Достаточно сказать, что на I Международном симпозиуме по клиническому применению ИФН, который состоялся в 1975 году в Институте иммунологии

âЗагребе, только две страны – СССР и Югославия – представили данные о лечебной эффективности ИФН при вирусных респираторных заболеваниях и местных вирусных поражениях.

Радикально изменились взгляды в западных странах на терапевтиче- ский потенциал ИФН только после публикации Н. Strander и K. Cantell данных по эффективному лечению остеогенной саркомы, полученных

âКаролинском радиологическом институте в Стокгольме [110]. Следует отметить, что в дальнейшем эти данные не подтвердились. И авторы сосредоточили свои исследования на лечении интерфероном ювенильного папилломатоза гортани и миеломной болезни и получили объективные положительные результаты. Длительное время на Западе приоритет отдавался изучению эффективности использования ИФН при онкологиче- ской патологии. Лишь в 80-х годах были начаты исследования по его использованию при системных вирусных инфекциях.

Созданный в конце 70-х годов прошлого столетия препарат «Челове- ческий лейкоцитарный интерферон для инъекций» был использован как препарат «выбора» для экспериментального лечения острого лимфобластного лейкоза у детей, а также лечения гепатита В и рецидивирующего

58

герпеса гениталий у больных. Положительные результаты лечения указанным препаратом позволили отечественной фирме «Интекор» (ИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи РАМН) наладить его широкомасштабный производственный выпуск в дозировках 0,1; 0,25; 0,5 и 1,0 млн МЕ /мл.

Первыми и традиционными лекформами ИФН, широко применявшимися в медицине, были растворы для интраназального введения и парентеральных инъекций. Как показала практика массового применения, нативные и концентрированные растворы ИФН являются эффективными при лечении практически всех вирусных инфекций – гриппа и ОРВИ, острых и хронических гепатитов А, В, С, герпетических инфекций, энцефалитов. Перспективным оказалось применение ИФН и в онкологии, особенно при гемобластозах. При солидных опухолях хорошие результаты были получены при использовании лейкинферона и ИФН для инъекций в комплексных схемах цитостатического лечения, когда они применялись в ка- честве иммунокорригирующего средства сопровождения [51].

Применение ИФН для интраназального введения основано на его взаимодействии с клетками слизистой оболочки, главным образом верхних отделов дыхательных путей, где происходит первый этап репродукции респираторных вирусов. «Антивирусное состояние» сохраняется непродолжительно, поэтому необходимы многократные инстилляции препарата. Впервые примененный при лечении гриппа интраназальный ИФНостается, безусловно, полезным и в наши дни, снижая заболеваемость вирусными инфекциями. Следует отметить, что его защитное действие не зависит от вида вируса, обусловившего развитие инфекции. Даже минимальный профилактический курс – 2 раза в неделю по 1000 МЕ – приводит к достоверному снижению заболеваемости ОРВИ как во время эпидемии, так и в последующем периоде при перманентном наблюдении в течение года. Крайне важно отметить, что препарат безвреден и нереактогенен, может применяться для детей в самом раннем возрасте, а также престарелыми, беременными и ослабленными больными.

Успешным является применение ИФН и в качестве средства лечения гриппа и различных вирусных инфекций [17]. Многократное интраназальное или ингаляционное введение раствора препарата через нос и рот

âформе аэрозоля в течение первых двух дней болезни приводит к более быстрому снижению явлений интоксикации и лихорадочной реакции, значительно уменьшается и выраженность воспалительных явлений

âверхних дыхательных путях, почти вдвое снижается продолжитель-

59

ность дней нетрудоспособности. Особо следует подчеркнуть, что интерферонотерапия гриппа уже в течение первых суток обеспечивает резкое подавление вирусоносительства в слизистой носоглотки [55].

При различных формах герпетического кератита, а также аденовирусного конъюктивита положительные результаты получены при многократных инстилляциях концентрированного ИФН в глаз. При более тяжелых формах вирусной патологии глаз, таких как язвы роговицы, кератоувеиты, требуется сочетание ежедневных субконъюнктивальных инъекций препарата ИФН с многократными его инстилляциями. Применение для этих целей нативного ИФН не рекомендуется из-за возможности развития явлений непереносимости .

Дозозависимыми являются и другие эффекты ИФН, поэтому использованная доза должна соответствовать целям терапии. Принцип «больше доза ИФН – лучше эффект», является верным при лечении гемобластозов. При вирусных инфекциях мозга и при генерализованных инфекциях необходимо использовать системно большие дозы ИФН (от 1,0 млн МЕ и более), что достигается применением высококонцентрированных препаратов ИФН для инъекций. Высокие дозы ИФН могут индуцировать целый ряд побочных реакций, это прежде всего подъем температуры, озноб, мышечные боли и др., определяемые, как «гриппоподобный эффект» [56]. Обычно реакции развиваются через 2 часа после инъекции препарата и могут сохраняться до 10 часов и более. Наиболее тяжело больные переносят обычно первую инъекцию, в дальнейшем нарастания реакции при продолжении курса лечения быть не должно. Чувствительность больных к этим реакциям индивидуальна. Обычно не требуется специальных мер для их снижения. Применение индометацина для снятия лихорадки допускается, так как мало влияет на терапевтический эффект ИФН.

Более серьезной реакцией на лечение интерфероном является индивидуальная депрессия кроветворения – лейко- и лимфопения. Учитывая, что клинический эффект ИФН связан прежде всего с активацией иммунных эффекторов, развитие депрессии кроветворения создает препятствия для введения слишком высоких доз ИФН- в течение одних суток (для природных – выше 3,0 млн МЕ, рекомбинантных – выше 9,0 млн МЕ).

Большой интерес представляет комплексный препарат ИФН- (5000 МЕ/мл) с цитокинами первой фазы иммунного ответа ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-, МИФ, ЛИФ - лейкинферон для инъекций. Используемый как действующее вещество, ЧЛИ синтезируется донорскими

60