Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

Проведенное исследование фармакокинетики мази с интерфероном не выявило никаких побочных реакций общего и местного характера в организме животных. Введение мази показало эффективное высвобождение ИФН из мазевой основы и хорошее всасывание его слизистой прямой кишки, слизистой носа и через кожу с последующим обнаружением противовирусной активности в сыворотке крови животных.

6.3. Оценка местнораздражающего действия мазевой лекарственной формы интерферона

Изучение местнораздражающего действия ИФН в форме мази проводили на 12 морских свинках весом 280,0–300,0 г. В течение всего эксперимента нами не выявлено каких-либо различий в общем состоянии и поведении животных опытных и контрольных групп, все животные выглядели здоровыми, падежа отмечено не было. Кожа в местах нанесения мази и основы без патологических изменений.

В эпидермисе экспериментальных и контрольных животных наблюдается хорошо видимые 5 слоев, представленные базальными клетками, шиповатыми клетками, зернистыми клетками, блестящими клетками, роговыми клетками. Толщина слоев одинаковая у всех животных. В дерме – многочисленные волосяные фолликулы, потовые, сальные железы. У некоторых животных в дерме имеется скудная очаговая лимфоцитарная инфильтрация. У животных всех экспериментальных групп в дерме наблюдается незначительное кровенаполнение кровеносных сосудов. Толщина дермы примерно одинаковая у всех животных.

Таким образом, втирание мази с интерфероном в кожу не приводит к каким-либо изменениям по сравнению с контрольными образцами, следовательно, мазь с интерфероном не обладает местнораздражающим действием.

6.4.Оценка общетоксического действия мази

ñинтерфероном

Доклиническая оценка безопасности мази с ИФН нами проведена в соответствии с «Требованиями к доклиническому изучению общетокси- ческого действия новых фармакологических веществ» [73]; «Правилами доклинической оценки исследований безопасности и эффективности фармакологических средств» [61].

101

Эксперименты проводили на крысах весом 200–250 г, которым ежедневно в течение одного месяца наносили мазь с ИФН на заднебоковую поверхность кожи площадью 2х2 см. Ежедневная доза на одно животное составляла 20000 МЕ. Эта доза в 40 раз превышала суточную терапевти- ческую дозу, рекомендуемую для человека.

Проведенные исследования показали, что крысы хорошо переносят воздействие мази с интерфероном и мазевой основы. В течение всего периода наблюдения не выявляется каких-либо патологических отклонений в поведении подопытных животных по сравнению с контрольной группой. Подопытные животные по поведению и внешнему виду не отличаются от контрольных. Все крысы выглядят здоровыми, падежа отмечено не было.

Изучено влияние ИФН в форме мази на динамику массы тела опытных и контрольных животных (табл. 26).

Ò à á ë è ö à 2 6

Влияние мази с интерфероном на изменение массы тела крыс

* р > 0,05– по отношению к контролю.

Проведенная статистическая обработка полученных данных показала, что динамика массы тела контрольных и опытных животных имеет однозначные показатели и статистически достоверно не отличается.

Âтабл. 27 представлены результаты оценки влияния мазевой основы

èмази с ИФН на состояние периферической крови экспериментальных животных – крыс. Фоновые показатели крови у всех животных статисти- чески достоверно не отличаются.

Как следует из табл. 27, показатели периферической крови до начала

èчерез месяц эксперимента внутри каждой опытной группы крыс статистически достоверно не отличаются. При контроле за состоянием пери-

102

ферической крови животных установлено, что мазь с интерфероном не вызывает значительных изменений количества эритроцитов и в лейкоцитарной формуле, а также концентрации гемоглобина. В табл. 28 отражены результаты изучения белоксинтезирующей функции печени.

* р > 0,05 – по отношению к контролю.

Ò à á ë è ö à 2 8

Оценка показателей активности ферментов в сыворотке крови крыс на фоне воздействия мази с ИФН и мазевой основы

* р > 0,05 относительно контрольной группы.

103

По нашим данным, ежедневное нанесение крысам мази с интерфероном и мазевой основы в течение одного месяца не оказывает существенного влияния на активность аланиламинотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ).

Ò à á ë è ö à 2 9

Оценка содержания общего белка в сыворотке крови крыс на фоне воздействия мази с ИФН и мазевой основы

* р> 0,05 относительно контрольной группы.

В табл. 29 представлены результаты определения влияния мазевой основы и мази, содержащей интерферон, на уровень белка в сыворотке крови экспериментальных животных. Установлено, что длительное применение мази с интерфероном и мазевой основы не оказывает отрицательного воздействия на белоксинтезирующую функцию печени крыс. Об этом свидетельствует отсутствие различий в уровне общего белка в сыворотке крови среди изучаемых групп животных.

Результаты оценки абсолютной и относительной массы внутренних органов крыс при длительном нанесении мази с ИФН и мазевой основы представлены в табл. 30.

Длительное нанесение крысам мази с интерфероном и мазевой основы не оказывает существенного влияния на массу органов опытных крыс. При патологоанатомическом вскрытии животных всех трех групп выявлено, что расположение внутренних органов правильное. Свободной жидкости в плевральной и брюшной полостях не выявляется. Просвет трахеи и бронхов свободен. Ткань легких розового цвета, без признаков отека. Слизистая оболочка желудка и кишечника розового цвета, без изъязвлений и кровоизлияний. Надпочечники без изменений. Печень при осмотре без признаков цирроза.

104

Гистологическое исследование органов и тканей крыс опытной группы по сравнению с контрольными не выявило структурных изменений, вызванных хроническим воздействием препарата. Из заключения по гистологическому исследованию органов и тканей опытных крыс следует, что патологических изменений, связанных с токсичностью препарата, не обнаруживается.

Ò à á ë è ö à 3 0

Абсолютная (г) и относительная (%) масса внутренних органов крыс на фоне воздействия мази с ИФН и мазевой основы

Таким образом, результаты проведенных доклинических исследований общетоксического действия мази с ИФН не выявили отрицательно-

105

го воздействия на организм экспериментальных животных изучаемого препарата. Применение мази в течение месяца не вызывает изменений в гематологических и биохимических показателях, не повреждает структуру внутренних органов, не оказывает местнораздражающего действия на организм экспериментальных крыс.

Контрольные вопросы к главе 6

1.Какие свойства интерферона учитываются при изучении биологической доступности in vivo?

2.Как определяют абсолютную биодоступность препарата?

3.Что такое местнораздражающее действие и как осуществляют его оценку?

4.Какие документы являются основополагающими при оценке безопасности лекарственных средств?

106

ГЛАВА 7 ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

К СОЗДАНИЮ СУБЛИНГВАЛЬНОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА

Âпоследние годы представление об иммунобиологических свойствах ИФН значительно расширилось. Помимо ранее известного противовирусного действия, проявляющегося в подавлении размножения различных вирусов, в том числе и онкогенных, показаны его радиопротективные свойства, а также участие в контрольно-регуляторных функциях организма, направленных на сохранение клеточного гомеостаза [4; 27; 69; 81].

Спектр биологического действия интерферона определил ему достойное место в арсенале лекарственных средств, эффективно используемых в практической медицине. Наиболее известны препараты ИФН в виде инъекционных растворов, лиофилизированных форм, ректальных

èвагинальных суппозиториев, мазей, аэрозолей, глазных капель и пленок, а также пероральных растворов[16; 62; 70].

Âнастоящее время из препаратов для перорального применения наиболее высокими потребительскими свойствами обладают таблеточ- ные формы, поскольку таблетки имеют ряд положительных качеств – малый объем, точность дозирования, удобство применения, хранения

èтранспортирования [39;57].

Âсвязи с этим создание пероральной таблеточной формы ИФН обусловлено также известными данными о наличии на поверхности слизистой ротовой полости рецепторов к интерферону, что было подтверждено исследованиями крупнейших фармацевтических фирм – производителей пероральных форм ИФН.

Ставя перед собой задачу разработать оральную таблетированную форму ИФН, мы исходили из того, что в отличие от энтеральных таблеток оральная таблеточная форма ИФН проста в изготовлении, ввиду от-

107

сутствия трудо¸мкой стадии нанесения кишечно-растворимой оболочки. Высвобождение из лекформы и воздействие ИФН на репликационную способность вирусов начинается раньше, уже через 1,5–3 мин, чем специфической субстанции, заключенной в кишечно-растворимые формы таблеток (2,5–3ч). Лекарственные вещества, принимаемые орально, быстро всасываются через слизистую оболочку ротовой полости благодаря обильной и поверхностно расположенной сети кровеносных сосудов. Они поступают в общий круг кровообращения, минуя протеолитический барьер желудочно-кишечного тракта и печени, через который проходят кишечно-растворимые лекарственные формы препарата. Данная лекарственная форма обеспечивает более длительный контакт (до 10 мин) действующего начала с инфицированными клетками слизистой ротовой полости по сравнению с жидкими препаратами.

Цель данного раздела – разработка препарата интерферона лейкоцитарного человеческого в форме таблеток. Известно, что лекарственные препараты, предназначенные для рассасывания в полости рта, не вызывают неблагоприятных эффектов и лишены недостатков инъекционных форм, улучшают потребительские качества препарата, увеличивают степень биодоступности и пролонгированности действия лекарственной субстанции и, как следствие, усиливают профилактический и терапевти- ческий эффект препарата.

7.1. Обоснование рационального состава и разработка способа получения сублингвальной таблетки интерферона

Качество таблетированных препаратов во многом зависит от выбора основы, которая, являясь носителем специфической активности, может влиять на скорость ресорбции, стабильность лекарственных веществ и терапевтическую эффективность [9].

Учитывая важность органолептических свойств лекарственных форм, предназначенных для рассасывания во рту, и плохие вкусовые ка- чества неочищенного ИФН, нами проведены исследования по очистке ИФН, полученного на стадии биосинтеза, как описано в гл. 3.

Таким образом, получали полуфабрикат ИФН, в котором были удалены как высокомолекулярные белки (плазмы крови, вирусные частицы и другие компоненты с молекулярной массой выше 300 кДа), так и низкомолекулярные фракции – ниже 10 кДа (антибиотики, метаболиты лейкоцитов, феноловый красный – индикаторный краситель среды 199). Се-

108

рии полуфабриката неочищенного и очищенного ИФН далее подвергали лиофильному высушиванию с целью получения сухой субстанции ИФН, необходимой для формирования таблеток. Полученный порошок интерферона собирали в стерильные флаконы, закрывали резиновыми пробками, обвальцовывали и хранили в холодильнике при (4 2)С до использования, но не более 6 мес. В этот период проводили контроль противовирусной активности интерферона.

Полученные серии сухой субстанции неочищенного и очищенного ИФН сравнивали по уровню противовирусной активности, массовой доли влаги (%) и вкусовым качествам. Данные сравнительной оценки препаратов ИФН представлены в табл. 31.

Ò à á ë è ö à 3 1

Сравнительная характеристика серий лиофилизированного неочищенного и очищенного ИФН

Как видно из табл. 31, примененные методы очистки ИФН практиче- ски не снижают его противовирусную активность, но значительно улуч- шают органолептические свойства.

По данным С.А. Носовицкой с соавторами [57], для улучшения вкусовых качеств таблетированных лекарств целесообразно добавлять водорастворимые наполнители (сахароза, лактоза, глюкоза, маннит), которые способны также повышать значения предельной и «буферной» влагоемкости, что существенно при прессовании таблеток. Кроме того, перечисленные выше дисахара обладают хорошей прессуемостью, сыпучестью, придают таблетке устойчивость при хранении, способствуют образованию прочных и в то же время быстро распадающихся таблеток. В связи с этим нами изучено влияние дисахаров (лактозы, сахарозы, глюкозы) на противовирусную активность ИФН на этапе формования таблеток (табл. 32). Исследование активности ИФН в таблетках проводили сразу после их формования (прессования).

109

Ò à á ë è ö à 3 2

Оценка влияния дисахаров на противовирусную активность ИФН в таблетке

* Расчетная противовирусная активность интерферона при формовании таблеток со-

ответствовала 7500 МЕ/табл.

Таким образом, дисахара не оказывают влияния на противовирусную активность ИФН на этапе их приготовления. Однако глюкоза и сахароза имеют недостаток – прилипание таблеточной массы на стадии формования таблеток к пуатсонам таблеточной машины. В дальнейшем при формовании таблеточной массы за основу нами была принята лактоза. Таблеточную массу оценивали по регламентированным показателям, принятым в провизорской практике, по однородности и сыпу- чести. В качестве активного вещества использовали как неочищенный, так и очищенный ИФН. Для приготовления таблеток применяли рас- четное количество лактозы, заимствованное из литературных источников. Данные по сравнительной оценке вышеуказанных показателей представлены в табл. 33.

Ò à á ë è ö à 3 3

Сравнительная оценка таблеточных масс, содержащих неочищенный и очищенный ИФН

* Расчетная противовирусная активность интерферона при формировании таблеток

соответствовала 7500 МЕ/табл.; **р < 0,05 – относительно показателей таблеточной мас-

сы, содержащей неочищенный ИФН.

110