Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

В то же время имеющийся уже довольно значительный опыт сравнительного лабораторного и клинического изучения природных и рекомбинантных ИФН свидетельствуют о том, что спектр медицинского применения природных и рекомбинантных ИФН и их клиническая эффективность неравнозначны. В связи с этим наиболее плодотворным может быть гармоничное развитие обоих направлений.

По определению В.П. Кузнецова (1996), лекарственные формы ИФН, предназначенные для местного и парентерального введения, делятся на две группы: препараты нативного типа и концентрированные. Препараты нативного типа по белковому составу практически не отлича- ются от исходных полуфабрикатов, характеризуются невысокой удельной активностью – до 1 104 МЕ на 1 мг белка, при этом в них сохраняются все цитокины, продуцированные в процессе интерфероногенеза, в их естественном соотношении. Схемы очистки этих препаратов включают удаление низкомолекулярных примесей с молекулярной массой до 5000 Да. Кроме того, для инъекционных препаратов этой группы в схемах очистки используют высокоспецифические иммуносорбционные методы удаления антигенных для человека компонентов. Лекарственные формы нативного типа ИФН обладают высоким потенциалом иммунобиологического действия.

Биотехнология получения концентрированных препаратов ИФН включает химическую очистку, что приводит к снижению потенциала иммунобиологического действия из-за утраты цитокинов. Однако эти препараты представляют определенную ценность для клинической практики. Например, высококонцентрированный человеческий лейкоцитарный ИФН для инъекций незаменим в ситуациях, когда необходимо введение высоких разовых доз при такой патологии, как лимфобластоидный лейкоз в стадии обострения, а также при лечении вирусных и онкологи- ческих поражений, локализованных за гематоэнцефалическим барьером.

В СССР работа над биотехнологическими методами получения медицинских препаратов ИФН была начата ещ¸ во второй половине 60-х годов прошлого столетия, причем одновременно в двух институтах: ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, в лаборатории, возглавляемой академиком АМН СССР профессором В.Д. Соловьевым, и в Центральном институте усовершенствования врачей на кафедре микробиологии под руководством академика АМН СССР З.Н. Ермольевой и профессора Т.А. Бектимирова.

21

Учитывая, что особенности того или иного заболевания требуют тщательного выбора лекарственной формы препарата, во многих случа- ях целесообразно местное применение ИФН, что позволяет локально влиять на клинический процесс, избегать отрицательных последствий, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИФН.

В 1967 году была начата работа по созданию первой лекарственной формы ЧЛИ для интраназального и ингаляционного применения в каче- стве средства профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Исследования, проведенные на добровольцах, подтвердили безвредность препарата при интраназальном введении, что послужило основанием для организации широких клинико-эпиде- миологических испытаний эффективности препарата в качестве средства профилактики гриппа. Испытание проходило в течение 1968–1969 гг. и совпало с эпидситуацией в стране, вызванной новым серотипом вируса гриппа А2(Н3N2) «Гонконг». Всего под наблюдением находилось 14 000 человек, включая детей дошкольного и школьного возрастов, а также контингент взрослых из организованных коллективов. Результаты проведенного исследования показали профилактическое действие препарата. Причем в период эпидемии гриппа в зависимости от конкретных условий, складывавшихся в очаге инфекции, заболеваемость снижалась в 2,3–3,2 раза по сравнению с общепринятыми методами лечения.

Данные отечественных исследований в дальнейшем были подтверждены болгарскими коллегами, использовавшими препарат производства ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. Первый успех имел очень большое значение для дальнейшего развития биотехнологических методов получения ИФН. В настоящее время в ряде крупных городов России: Москве, Санкт-Петербурге, Перми, Уфе, Томске организовано производство человеческого лейкоцитарного интерферона для интраназального применения. Благодаря этому десятки миллионов доз препаратов ИФН поступают в аптечную сеть.

Технологию получения концентрированных препаратов ИФН-альфа разработали в Финляндии. Она основана на осаждении ИФН радонатом калия при низких значениях рН с последующей экстракцией его в подкисленный этанол и поэтапном осаждении из этанольного раствора сна- чала балластных примесей, а затем и активной фракции. Этим методом впервые удалось очистить и сконцентрировать природный препарат ИФНдо удельной активности, соответствующей 1 млн МЕ на 1 мг бел-

22

ка [109]. Данный способ получения ИФН неоднократно совершенствовался [90;91;92;93]. Финская технологическая схема получения ЧЛИ имеет положительные качества – легкая воспроизводимость и гарантированная безопасность препарата. Однако следует отметить и недостатки. Это относительно высокие потери активности в процессе очистки (до 50%), отсутствие специальных операций, предназначенных для удаления антигенных примесей индуктора.

ÂИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР в 1977 году была разработана схема получения высокоочищенного и концентрированного препарата ЧЛИ для инъекций, имевшая ряд существенных отличий. Она включала специальную операцию удаления антигенных примесей, содержала дублирующую операцию инактивации вирусов введением хлороформа [49].

После фармакологического изучения и подтверждения защитного противовирусного действия препарата ИФН на модели осповакцины обезьян уже в 1978 году были развернуты клинические испытания эффективности препарата при вирусных инфекциях (различных клинических формах гепататита В, постгриппозного и поствакцинального менингоэнцефалита, рецидивирующего герпеса гениталий), а также онкологических заболеваниях (остром лимфобластоидном лейкозе, ювинильном папилломатозе гортани и др.).

Â1982 году при сравнительном изучении способности нативного полуфабриката и изготовленного из него высокоочищенного ЧЛИ для инъекций активировать естественные киллеры был установлен принципиально важный факт снижения ЕК-стимулируюшего действия препарата после химической очистки. Было высказано предположение, что хотя активация ЕК является прямой функцией ИФН в процессе интерфероногенеза, индуцированные клетки синтезируют и другие медиаторы иммунного ответа, выполняющие хелперную функцию в отношении акти-

вации ЕК. Такой активностью обладают, например, интерлейкин-2 и фактор некроза опухоли. В дальнейшем была проведена целая серия работ по сравнительному исследованию иммунобиологических свойств нативных полуфабрикатов ИФН и лекарственных форм с различной степенью очистки. Наряду с хелперными факторами ЕК-стимуляции в нативном полуфабрикате были обнаружены факторы, ингибирующие миграцию макрофагов и нейтрофилов, а также активирующие фагоцитирующую функцию этих клеток. Был обнаружен новый интересный фактор, обладающий способностью тормозить рост стафилококков

23

в культуре in vitro. Действие его проявлялось в отношении клинических штаммов стафилококка, устойчивых к антибиотикам.

Широкий спектр медиаторов иммунного ответа, продуцируемых индуцированными клетками в процессе интерфероногенеза, представляет несомненный интерес с практической точки зрения [54]. Анализ литературы показывает, что сохранение всего спектра медиаторов в лекарственной форме положительно влияет на клиническую эффективность препаратов, по крайней мере, при инфекционных заболеваниях. Однако указанные выше процессы опосредованы большим разнообразием эффекторных молекул, различающихся по физико-химическим свойствам, поэтому химическими методами очистки невозможно в достаточно полной мере сохранить их в препарате. Для этого необходимы новые поиски

èисследования методов очистки.

Ñ1982 года основой концепции производства ИФН профессора В.П. Кузнецова стало обеспечение безвредности природных препаратов ИФН. Лейкоциты донорской крови, предназначенные для получения природных препаратов ИФН, допускают к переработке только при отрицательных результатах контроля иммуноферментным методом определения наличия специфических антител к ВИЧ, антигенов вирусов гепатита В и С, реакции Вассермана, а также определения уровня билирубина, трансаминаз.

Потенциальную опасность в препаратах крови могут представлять также цитомегаловирус, В-лимфотропный вирус НВLV, а также ретровирус Т-клеточной лейкемии взрослых. До настоящего времени контроль донорской крови на станциях переливания крови на наличие указанных вирусов не проводится. Следует подчеркнуть, что все указанные вирусы потенциально опасны при трансфузии нативной крови или е¸ компонентов. Однако при производстве лекарственных форм ИФН всегда имеется возможность широко применять методы химической инактивации вирусов-контаминантов.

Для повышения надежности химическая инактивация должна строиться на использовании не менее двух дезинфектантов с разным механизмом действия. Белковая природа интерферонов и их относительная хими- ческая лабильность серьезно ограничивают арсенал средств инактивации. Широко распространенная обработка полуфабрикатов соляной кислотой

при рН 2,2 0,2 подкупает своей простотой. Однако вирус гепатита В (ВГВ) устойчив к такой обработке. В то же время ВГВ и ВГС обладают

24

высокой чувствительностью к хлороформу, как и другие липидсодержащие вирусы, включая также ВИЧ [50]. Многие вирусы инактивируются перекисью водорода, которая подавляет инфекционность аденовирусов, риновирусов, респираторно-синцитиальных вирусов, коронавирусов и др. Этанол в концентрации 20–80% эффективно инактивирует ВИЧ и ВГВ.

Эффективность этих рекомендаций была проверена в модельных опытах на вирусах-ВБН (липид-зависимый) и вируса полиомиелита типа 1 (липиднезависимый). Все приведенные ниже технологические схемы обеспечивали полную инактивацию этих вирусов, искусственно введенных в полуфабрикаты ИФН в дозе 100 ТЦД50, без существенного влияния на активность ИФН.

В лекарственных формах рекомбинантных ИФН часто используют человеческий донорский альбумин в качестве стабилизатора. Это также может стать причиной контаминации препарата человеческими вирусами. В силу этих причин перед использованием раствор альбумина должен подвергаться химической инактивации.

Вид ИФН, продуцируемого в культурах лейкоцитов, определяется прежде всего природой индуктора. При вирусной индукции (чаще для этих целей используют ВБН или вирус Сендай) в культуре лейкоцитов, полученных от донора, продуцируется преимущественно ИФН-. Те же вирусы в культуре клеток доноров, предварительно сенсибилизированных этими вирусами, индуцируют ИФН-. Этот же вид ИФН синтезируется и при воздействии Т-митогенами. В последнем случае нет необходимости в предварительной сенсибилизации [52].

Под действием индукторов (вирусов, антигенов), а также в результате смешивания лимфоцитов различного генотипа, т.е. от разных индивидуумов, суспензии лейкоцитов наряду с ИФН продуцируют и ряд других медиаторов иммунного ответа – цитокинов. Присутствие цитокинов, синтезированных в процессе интерфероногенеза, повышает потенциал иммунобиологического действия препаратов ИФН. Сохранение широкого спектра цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО, МИФ и др.) в препаратах ИФН открывает новые возможности повышения терапевтической эффективности препаратов ИФН.

Повышение клинической эффективности рекомбинантных ИФН может быть достигнуто также путем создания комплексных препаратов. Примером тому служат данные о создании мазей, содержащих кроме рекомбинантного ИФН и ряд цитокинов, в частности интерлейкин-2 или

25

фактор некроза опухоли альфа (ФНО-). Такие мази используют в качестве противоопухолевого средства местнорезорбтивного действия [83].

Показано, что при различных патологиях препараты ИФН для местного применения (интраназальные капли, мазь, ректальные суппозитории, коллагеновые пленки, глазные пленки и др.) более эффективны, чем инъекционные. Например, при хроническом ВГВ использование ректальных свечей, содержащих всего 40 000 МЕ ИФН-, дает такие же результаты (улучшение биохимических показателей функции печени, уровня трансаминаз, снижение антигенемии, частота сероконверсий), как и внутримышечное введение высоко концентрированного препарата в дозе 3 млн МЕ. Расход препарата и стоимость лечения при применении ректальных суппозиториев снижается в десятки раз.

Каждая лекарственная форма имеет свою область применения, обусловленную иммунобиологическими и фармакологическими свойствами. Биосинтез ИФН для приготовления различных лекарственных форм может проводиться по единой технологической схеме, но способы очи- стки ИФН и е¸ уровень должны отвечать задачам терапии. В инъекционных лекарственных формах компоненты, антигенные для человека, должны отсутствовать, а их уровень в препаратах для местного использования должен быть ниже порога сенсибилизации.

В природных препаратах ИФН-альфа могут присутствовать 3 основные группы антигенов: 1-я – антигены вируса индуктора и аллантоисной жидкости куриного эмбриона; 2-я – группоспецифические антигены эритроцитов, включая также антигены резус-фактора; 3-я – антигены главного комплекса гистосовместимости НLА.

Биотехнология получения ИФН должна включать операции, ограни- чивающие возможность сохранения этих антигенов в лекарственных формах. Технологически наиболее трудной задачей является удаление антигенов 1-й группы, так как на стадии индукции их вводят в клеточную суспензию в большом количестве. По унифицированной схеме биосинтеза ИФН-, предложенной В.П. Кузнецовым в 1983 г. для снижения содержания антигенов 1-й группы в полуфабрикатах, процесс биосинтеза проводят в две стадии: после инфицирования вирусом – интерфероногеном донорские лейкоциты отделяют от питательной среды с помощью центрифугирования и затем на стадии синтеза их объединяют со свежей порцией питательной среды. Для лекарственных форм местного применения этого достаточно, но для инъекционных препаратов необходимы дополнитель-

26

ные операции для удаления вирусных антигенов. Наиболее эффективны иммуноадсорбционные методы с использованием антител, иммобилизированных на нейтральных носителях.

Для контроля степени очистки препаратов ИФН от антигенов 1-й группы были разработаны иммуноферментные тест-системы, обладающие высокой чувствительностью в пределах 3 нг/мл. Во всех инъекционных препаратах, выпускаемых в России, уровень антигенов 1-й группы ниже пределов чувствительности существующих диагностических тест-систем. Вместе

ñтем в зарубежных препаратах эти антигены выявлялись [49].

Âпроцессе культивирования лейкоэритромассы эритроциты легко разрушаются механически при роллерном перемешивании для поддержания клеток в суспензионном состоянии или под действием индукторов. Продукты их распада токсичны для лейкоцитов и снижают способность клеток к интерфероногенезу. Группоспецифические антигены эритроцитов и резус-фактор при попадании в препарат могут вызывать явления сенсибилизации у лиц, применяющих эти препараты. Наряду

ñэтим высокое содержание гемоглобина также ухудшает физико-хими- ческие свойства препарата ИФН. Все это диктует необходимость удаления эритроцитов из лейкомассы. Основной технологической операцией, исключающей присутствие антигенов 2-й группы в лекарственных формах, является гемолиз эритроцитов в растворе хлорида аммония с последующим удалением гемолизата. Эта простая операция широко применя-

ется при производстве ИФН-, но должна быть исключена при производстве ИФН-, так как резко уменьшает активность препарата.

По современным представлениям наиболее эффективным и химиче- ски мягким методом качественного удаления антигенов 3-й группы является метод истощающей иммуносорбции. Этот метод достаточно надежен при небольших количествах антигена. Процесс заключается в следующем: специфические антитела к антигенам 3-й группы, сшитые с имуносорбентом, связываются с комплементарными антигенными компонентами, а ИФН свободно проходит через колонку с иммуносорбентом.

Технология производства ИФН начинается с операции выделения лейкоцитов из крови. Метод фракционирования направлен на получе- ние лейкоцитарной фракции, свободной от примеси эритроцитов. Это довольно трудная задача, так как используемые методы должны быть достаточно щадящими и не должны подавлять функциональную активность лейкоцитов. Методы получения чистых лейкоцитов для клиниче-

27

ских и экспериментальных целей разрабатывались на протяжении многих лет. Для освобождения от эритроцитов используют методы ускорения их седиментации с помощью растворов декстрана, желатины, метилцеллюлозы и других растворов. Использование метода двойного химического гемолиза, как правило, отрицательно сказывается на функциональной активности выделенных лейкоцитов. Показано, что выход ИФН при этом методе в расчете на один лейкоцит ниже, чем при использовании стадии фракционирования.

Наиболее распространенные индукторы интерфероногенеза-альфа – вирус болезни Ньюкасла (ВБН) и вирус парагриппа Сендай в процессе синтеза сорбируются на рецепторах эритроцитов, поэтому инфекционная активность вирусов в значительной мере снижается в смешанных культурах.

Процессы выделения лейкоцитов проводят в условиях, тормозящих метаболические процессы. В связи с этим для продуктивного синтеза ИФН необходимо восстановление физиологической и биохимиче- ское активности донорских лейкоцитов после многоэтапного процесса выделения их из крови, что достигается с помощью стадии «прайминг». Праймирование – очень интересный феномен, связанный с продукцией ИФН [80]. Суть его заключается в способности клеток, предварительно обработанных относительно низкими дозами ИФН, синтезировать существенно больше ИФН по сравнению с предварительно не обработанными им клетками [5]. Праймирование широко применяют для увели- чения выхода целевого продукта в крупномасшабном производстве ИФН. Однако эффективность зависит от условий культивирования лейкоцитов и использованной дозы ИФН. В производстве ЧЛИ наиболее эффективными условиями стадии «прайминг» являются суспензионное культивирование лейкоцитов в присутствии нативного ИФН в дозе не менее 100 МЕ/ мл. Дальнейшее повышение дозы не увеличивает активность ИФН, но и не тормозит интерфероногенез.

Важное значение имеет и оптимизация условий синтеза ИФН донорскими лейкоцитами: подбор белкового компонента среды, упрощающего задачу последующей очистки препарата, определение концентрации лейкоцитов, позволяющей получить максимальное количество ИФН. В процессе альфа-интерфероногенеза не происходит деления кле- ток-продуцентов. Количество ИФН, синтезированного в суспензии за один цикл его продукции, относительно невелико. Так, при концентра-

28

ции 6–8 млн лейкоцитов на мл питательной среды средний выход ИФН-альфа достигает 6,4 104 МЕ/мл, что свидетельствует о невысокой потребности клеток в питательных веществах на этой стадии.

При культивировании более концентрированных суспензий лейкоцитов (до 10 млн в мл) исключительно важное значение приобретает буферная ¸мкость среды, поскольку лейкоциты имеют ряд особенностей энергетического обмена. Окисление глюкозы – основного энергетиче- ского субстрата среды, происходит в гликолитическом цикле до образования лактата. Накопление последнего приводит к закислению среды, причем снижение рН среды создает серьезное препятствие для дальнейшего продуктивного развития процесса интерфероногенеза. Для поддержания оптимума рН используют дорогостоящие органические буферные системы, в их числе Hepes, трицин или бикарбонат – СО2. Оптимизация процесса биосинтеза возможна также за счет специальных сред с минорным содержанием неорганического фосфата.

До настоящего времени наиболее широкое распространение получи- ла схема биосинтеза ИФН-, разработанная в Финляндии [93]. Указанная технология характеризуется простотой и надежностью: лейкоциты выделяются из лейкомассы химическим гемолизом. Стадии «прайминг», «индукция» вирусом Сендай и «биосинтез» проводят одностадийно в минимизированной среде «Игла» с содержанием трицина и дефицитом неорганического фосфата. В качестве белкового компонента используют агаммасыворотки. Биосинтез проводят в простых колбах, погруженных в водяную баню, установленных на магнитной мешалке. Ритмичность получения сырья в необходимом объеме обеспечивают четкой координацией работы производственной лаборатории и Службы крови Финляндии. Основным недостатком финской технологии является е¸ одностадийность, обуславливающая высокий уровень содержания антигенов вируса индуктора и компонентов аллантоисной жидкости КЭ в полуфабрикате, что не позволяет получить медицинский препарат ИФН нативного типа, очищенный и концентрированный.

Российскими исследователями была предложена двухстадийная технологическая схема биосинтеза ИФН, предусматривающая смену среды после вирусной индукции, что позволяло, с одной стороны, снизить уровень вируса индуктора в полуфабрикате, а с другой стороны, обеспечивало возможность дифференцирования среды в зависимости от задач стадии. Например, введение гормональных добавок на первой ста-

29