Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на
..pdfлейкоцитами в суспензионной культуре с нагрузкой лейкоцитов 6–10 млн/мл. В качестве интерфероногена применяют вирус болезни Ньюкасла. Синтезированный ИФН очищают от низкомолекулярных компонентов с помощью сефадекса G-25 с последующей иммуносорбцией. Лейкинферон обладает мощным иммунокорригирующим действием и снимает явления вторичного иммунодефицита не только при вирусных инфекциях, но и при бактериальных заболеваниях, таких как туберкулез, хламидийно-микоплазменные урогенитальные инфекции, сепсис, перитонит, кожный лейшманиоз и другие [48;49;50;51].
К концентрированным препаратам ИФН относят «Интерлок», который успешно применяют для лечения вирусных поражений глаз. Препарат «Интерлок» отличается тем, что очистку ЧЛИ ведут путем осаждения его сульфатом аммония, растворением осадка в 2-8 М мочевине и с последующей гельфильтрацией на колонке акрилекс П-60 для удаления низкомолекулярных фракций до 10 Кда [41].
В последнее время был создан еще один препарат, содержащий очи- щенный человеческий лейкоцитарный ИФН- – «Локферон» (г. Москва), в котором в качестве индуктора используют штамм вируса парагрип- па-1 Сендай. Синтезированный таким образом интерферон подвергают очистке ультра- и диафильтрацией на мембранах с порогом отсечения 5 кДа и последующей концентрацией на ультрафильтрационных мембранах с порогом отсечения 100 кДа. Данный препарат нашел широкое применение при лечении вирусных заболеваний глаз [85].
3.2. Мягкие лекарственные формы интерферона
При поражениях слизистых оболочек и кожи, прежде всего при герпетической инфекции, обусловленной вирусами I и II типов, ветряной оспе и других жидкие лекарственные формы, как правило, не обеспечи- вают поддержания необходимого уровня активации иммунных эффекторов в очаге инфекции. Это может быть достигнуто лишь при использовании интерферона в виде мягкой лекарственной формы – мази.
Еще в самом начале клинического изучения лечебной эффективности ИФН для местного применения на открытых пораженных вирусом герпеса поверхностях была рекомендована мягкая лекарственная форма ИФН для наружного применения – интерфероновая мазь. Лече- ние мазями с ИФН оказалось эффективно при дерматозах различной
61
этиологии, псориазах, хроническом тонзиллите, герпетическом стоматите, неспецифическом язвенном колите дистальных отделов кишечника, рецидивирующем герпесе, кожном лейшманиозе [21;44] Уже в середине 70-х годов обращали внимание на способность нативного ИФН- в мазевой лекарственной форме не только способствовать заживлению вирусных поражений слизистых, но и санировать гнойные раны и стимулировать репаративные процессы в длительно незаживающих ранах и трофических язвах. Это были первые прямые свидетельства способности нативных ИФНне только вызывать состояние невосприимчивости к вирусной инфекции, что было догмой для того времени, но и одновременно оказывать активирующее действие на другие иммунные реакции.
Разработка технологии приготовления мазей, содержащих челове- ческий лейкоцитарный или рекомбинантный интерферон, остается актуальной и в наши дни [17;58; 83]. Первые мази с человеческим лейкоцитарным интерфероном были изготовлены на основе ланолина безводного с косточковым маслом. Ланолин является хорошей природной гидрофобной основой, однако затрудняет высвобождение ИФН, препятствуя не только биодоступности специфического начала, но и проведению контроля активности препарата, хотя и не влияет на биологи- ческое действие ИФН.
В последнее время разработана мазь на основе рекомбинантного альфа-2-интерферона и гидрофильной основы с использованием гидрата окиси алюминия с добавкой поливинилового спирта, обеспечивающего необходимую консистенцию лекформы и способствующего пленкообразованию при высыхании на коже. Мазь применяется для лечения герпетических инфекций кожи и слизистых оболочек.
Для профилактики и лечения ОРВИ разработана мазь, содержащая комплексный иммуноглобулиновый препарат и рекомбинантный человече- ский ИФН- 2. (КИП). Использование указанной мази позволило уменьшить частоту возникновения ОРВИ, а в случае развития заболевания значительно сократить его длительность и уменьшить число осложнений.
Создана мазь, содержащая рекомбинантный ИФН- 2 и витамины Е и С, повышающие окислительно-восстановительный потенциал. Имеются данные о создании мазей, содержащих кроме ИФН и ряд цитокинов, в частности интерлейкин-2 или ФНО-. Такие мази используются в каче- стве противоопухолевого средства местнорезорбтивного действия.
62
Зарубежные сообщения о применении ИФН-содержащих мазей весьма редки. Широкое использование мазей лимитируется коротким сроком годности, который не превышает четырех месяцев [2].
Универсальной лекарственной формой ИФН, оказывающей как местное, так и некоторое системное действие, являются суппозитории с ИФН. Эффективность суппозиториев как лекарственной формы определяется не только ИФН, но зависит и от основы, которая может влиять на биодоступность ИФН и его стабильность. ИФН из суппозиториев всасывается в нижней части прямой кишки через лимфатическую и венозную систему малого таза, легко проникает непосредственно в кровяное русло и далее, через воротную вену достигает печени [33;38].
На сегодняшний день в России разработано несколько видов суппозиториев, отличающихся как по уровню содержания активного начала и его природе, так и по качественному составу суппозиторной основы. На основе ЧЛИ в настоящее время выпускаются суппозитории на липофильной основе [15] и с использованием гидрофильной основы (НПО «Иммунопрепарат», г. Уфа).
С рекомбинантным ИФН- 2 на липофильной основе с добавками антиоксидантов разработан препарат «Виферон» с различной противовирусной активностью 100000, 250000, 5000000 МЕ /свече. Группой российских исследователей по руководством П.А.Джумиго разработан препарат для лечения вирусных, хламидийных и бактериальных инфекций, приготовленный на основе ИФН с активностью 500000 МЕ и альфа-токоферола ацетата 0,01–0,2 г [26]. Кроме того, создан препарат «Кипферон», содержащий в своем составе рекомбинантный -, - или - ИФН человека и смесь нормальных или специфических иммуноглобулинов IgA, IgM и IgG [67].
Перспективным направлением является создание комплексных препаратов, где наряду с ИФН в лекарственные формы вводят и его индукторы, которые являются средством неспецифического противовирусного действия, препятствуя репликации вирусов и способствующие их элиминации [23].
Как показали результаты клинической оценки в педиатрической практике, лекарственная форма ИФН в виде суппозиториев имеет ряд преимуществ. ИФН хорошо всасывается и уже через 30 минут определяется в сыворотке крови детей, обычно достигая максимума к 4-му часу, но через 12 часов его уровень в сыворотке уже минимален.
Подтверждена клиническая эффективность суппозиториев при лече- нии больных вирусными заболеваниями (вирусные гепатиты, клещевой
63
энцефалит и др.), а также при некоторых смешанных урогенитальных инфекциях, в частности при хламидиозе, уреаплазмозе, микоплазменных поражениях и различных аутоиммунных заболеваниях, гломерулонефритах, ревматоидных артритах и других [75;76].
3.3.Таблетированные формы интерферона
Âпоследние годы внимание исследователей было обращено к разработке новой лекарственной формы – таблеток с ИФН-. Моделирование состава наполнителей и поверхностного слоя таблетки позволяет специфической субстанции проникать в организм, минуя протеолитиче- ский барьер верхних отделов желудочно-кишечного тракта без потери или снижения активности.
Приготовление таблеток выгодно отличается от других лекарственных форм возможностью полной механизации производственного процесса, высокой точностью дозировки. К тому же способ их применения достаточно прост. Они удобны в хранении и транспортировании и могут быть достаточно экономичными. Внедрение в практику здравоохранения таблетированных форм ИФН открывает, с одной стороны, перспективы для увеличения выпуска ИФН-содержащих препаратов за счет интенсификации технологических процессов, с другой стороны, пероральный метод применения без предварительного растворения делает терапию легкодоступной. Во многих странах широко проводятся исследования по обоснованию и изучению целесообразности перорального введения препаратов ИФН. Важный аргумент в пользу перорального применения таблеток с ИФН был получен G. Kaiser и H. Laeger [102], показавших отсутствие в ротовой полости протеолитических ферментов.
Кроме того, в 1991 году на модели мыши было установлено [99], что при пероральном введении растворов ИФН супрессия лейкоцитов не отменяется специфическими антителами к ИФН, но индуцируется у интактных мышей клетками крови, супрессированных оральным применением ИФН животных. Можно предположить, что в этом случае супрессия опосредована иммунными эффекторами, активированными ИФН местно, по-видимому, в ротовой полости. При подкожном введении ИФН механизм супрессии, напротив, был связан с циркулирующим ИФН, и введение специфических к ИФН антител отменяло развитие супрессии.
64
Получены положительные результаты лечения хронического вирусного гепатита В таблетками с природным ИФН-, абсорбируемым слизистой оболочкой полости рта. Суточная доза ИФН составляла от 75 до 200 МЕ. Больные рассасывали таблетку в полости рта до полного растворения. Курс лечения составлял от 120 до 300 дней. На фоне терапии натуральным ИФНпроисходила элиминация как НВеАg, так и НВsАg и появлялись ан- ти-НВе и анти-НВs антитела. Из 23 больных с вирусемией в начале курса терапии ИФН у 12 была зарегистрирована специфическая сероконверсия. Ни у одного больного с сероконверсией не было отмечено рецидива гепатита В в течение года после прекращения терапии ИФН-. Полученные данные позволили сделать вывод об эффективности и безопасности лечения больных хроническим вирусным гепатитом типа В природным ИФН- в виде таблеток [89].
Пероральное введение в порошке мальтозы природного ИФН- в дозе 1 МЕ/кг приводило у больных СПИДом к возрастанию количества лимфоцитов, прибавлению в весе и улучшению общего состояния. Материалы отчета о клиническом изучении действия таблетированного интерферона альфа (ИФН-) на больных, серопозитивных в отношении вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), свидетельствовали о том, что введение данной формы ИФН приводило к увеличению веса пациентов, увеличению числа СД4 лимфоцитов, улучшению клиниче- ского состояния обследуемых. Больные получали ИФН в дозе 72–600 МЕ в день на протяжении 19–700 дней.
Известно, что применение ЧЛИ реr оs в дозе 1, 10 или 20 МЕ в течение 4 дней в период вспышки инфекционного гастроэнтерита у 1–12-дневных поросят позволило существенно повысить их выживаемость.
Одним из основных направлений использования таблетированных форм ИФН может оказаться профилактика и раннее лечение острых респираторных инфекций, вирусной ангины, стоматитов и другие ИФН в этой лекарственной форме не только оказывает местное действие в ротовой полости, но и через активацию иммунных эффекторов может оказывать также и системное действие.
Л.А. Денисовым и соавторами [25] разработана для перорального применения таблетированная форма рекомбинантного ИФН- 2 , имеющая наполнитель следующего состава: лактоза, сахароза, стеарат кальция, ацетилфталилцеллюлоза, касторовое масло в смеси ацетона со спиртом. По данным авторов, препарат при пассаже через желудочно-кишечный тракт
65
проходит неизмененным верхние отделы желудочно-кишечного тракта, так как покрыт кислотоустойчивой оболочкой, которая предохраняет его от протеолиза.
В США фирмой Interferon Scientists были проведены клинические испытания низкодозного перорального интерферона, названного Aleferon
(R) LDO, при лечении больных, инфицированных ВИЧ. В испытаниях участвовали 45 больных ВИЧ-инфекцией или имеющих симптомокомплекс СПИДа. Для лечения использовали три различные дозы препарата. Позитивные результаты испытаний обеспечили фирме получение лицензии на использование этого препарата в терапевтических целях.
Компании Cortecs (Великобритания) и Western Capital (Австрия) подписали соглашение о производстве пероральной формы рекомбинантного человеческого эритропоэтина и ИФН-, разработанных Orto-Bioteu Hoffman-LaRoche.
Фирма Amarillo Cell Culture представила данные о результатах лече- ния больных СПИДом вафлями, содержащими ИФН-. В процессе исследований было установлено, что при таком лечении у больных увеличивалось количество циркулирующих лимфоцитов. На протяжении всего срока приема (6 месяцев) у этих больных наблюдали исчезновение основных симптомов заболевания. Механизм указанного эффекта еще не выяснен.
Заслуживает внимания сообщение о разработке еще одной пероральной лекарственной формы ИФН, в создании которой использованы качественно новые комбинации наполнителя, которая нетоксична и легко всасывается в желудочно-кишечном тракте. В состав наполнителя входят 5–100 ммоль ненасыщенных жирных кислот (линоленовая, линолевая, олеиновая и др.), 0,2–4% эфиров полиоксиэтилена и жирных кислот, эфиров алкилполиоксиэтилена или других поверхностно-активных веществ. При дозе ИФН около 10 млн МЕ использованный наполнитель повышает устой- чивость ИФН к воздействию протеолитических ферментов и позволяет специфической составляющей всасываться из желудочно-кишечного тракта. Крайне интересно, что эта лекарственная форма хотя и применяется перорально, но обеспечивает высокую концентрацию ИФН в сыворотке крови и, следовательно, имеет перспективы для лечения самых различных вирусных инфекций, в частности в комплексной терапии больных гломерулонефритом, ассоциированным с НВ-вирусной инфекцией.
Сотрудниками Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» был создан препарат для перорального применения
на основе рекомбинантного ИФН- 2 , заключенного в липосомы, содержащие фосфатилхолин, холестерин, альфа-токоферол, витамин С и сахарозу. Данный препарат обладает высокой устойчивостью к воздействию желудочного сока и хорошо всасывается в проксимальном отделе тонкого кишечника. В настоящее время ЗАО «Вектор-Медика» приступило к выпуску данного препарата под названием «Реаферон-ЕС-Липинт».
На основе ИФНразработан иммуномодулирующий препарат «Неоферон» с противовирусной активностью как для парентерального введения, так и в форме таблеток для приема реr оs, содержащий комплекс рекомбинантных цитокинов: гибридного белка Т-ФНО-Т (-тимозин и фактор некроза опухолей), в который введена рекомбинантная плазмида рТhy 325, кодирующая синтез белка, ИФН-2, продуцируемого штаммом Å. ñîli, содержащего в плазмиде ген, кодирующий экспрессию указанного белка; интерферона -, экспрессируемого штаммом Å. cîli Ìñ 106 [34].
Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что разработка и создание новых лекарственных форм ИФН все еще остается актуальной и перспективной. Препараты ИФН обладают высокой профилактической и лечебной эффективностью при различных заболеваниях, а наличие различных лекарственных форм позволяет добиться максимальных терапевтических результатов при наименьшей стоимости затрат на их производство.
Контрольные вопросы к главе 3
1.Присутствие каких аминокислот у рекомбинантных интерферонов влияет на сенсибилизацию организма человека?
2.Какие технологии используются для производства жидких лекарственных форм интерферона в России?
3.Какие мягкие лекарственные формы существуют на основе интерферона?
4.Каковы основные преимущества таблетированных лекарственных средств?
5.Что служит основанием для создания пероральной лекарственной формы интерферона?
6.Какие пероральные формы интерферонов известны в мире?
ГЛАВА 4
ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУППОЗИТОРИЕВ
Известно, что в процессе интерфероногенеза индуцированные вирусами лейкоциты продуцируют широкий спектр цитокинов – медиаторов иммунного ответа. Сохранение их в лекарственной форме ИФН целесообразно для повышения терапевтической эффективности препарата. Введение дополнительных методов очистки в технологиче- скую схему получения природных препаратов ИФН чаще всего сопровождается снижением потенциала иммунобиологического действия, а также существенно увеличивает их стоимость. Целый ряд работ посвящен сравнительному изучению иммунобиологических свойств нативных и концентрированных препаратов ИФН. Результаты много- численных сравнительных лабораторных и клинических исследований, представленных в литературе, позволяют заключить, что препараты нативного ИФН более насыщены биологически активными факторами и оказываются высокоэффективными при клиническом применении.
Ранее разработанный нами способ получения суппозиториев с интерферон лежал в основе создания лекарственной формы ЧЛИ нативного типа. Результаты проведенных клинических испытаний на модели острого вирусного гепатита В (ВГВ) свидетельствовали о перспективности использования данной лекарственной формы при указанной патологии. Возможность и необходимость расширения спектра клинического применения интерферона обусловливает актуальность совершенствования способа изготовления суппозиториев.
В данной главе представлены материалы по выбору оптимального состава суппозиторных основ, обоснованию новых подходов к разработке готовой лекарственной формы, а также совершенствованию метода контроля специфической активности ИФН, заключенного в липофильные основы.
68
4.1. Оценка влияния жировых основ на активность интерферона в суппозиториях
Эффективность суппозиториев любой лекарственной направленности во многом зависит от основы, которая влияет на скорость резорбции специфического начала и его стабильность в лекарственной форме, обусловливая терапевтическую эффективность препарата [46]. Все основы, использованные нами, характеризуются как гидрофобные и были разрешены к медицинскому применению в России. Для придания необходимых физико-химических и структурно-механических свойств в основы суппозиториев мы вводили поверхностно-активные вещества, широко применяемые в производстве мягких лекарственных форм – это прежде всего моноглицериды дистиллированные (МГД).
Основываясь на ранее проведенных исследованиях, мы пришли к выводу, что наиболее оптимальными основами являются липофильные, то есть жировые основы, в частности твердый кондитерский жир с эмульгатором Т–2 [15]. Данная основа обладает рядом положительных свойств: температура плавления 35–37 îС, устойчивость при хранении после стерилизации паром. Однако при этом срок хранения данной основы был всего 1 год. Учитывая возможность сохранения свойств ЧЛИ в течение двух лет в лиофилизированном состоянии, нами была предпринята попытка поиска липофильных основ со сроком хранения более 2 лет. Ими оказались основы марки «Витепсол», срок хранения которых составляет 3 года с момента выпуска. В качестве сравнения мы использовали твердый кондитерский жир типа С (ФС 42-1117-86).
Суппозиторные основы должны отвечать требованиям, определяемым особенностями лекарственной формы, в частности обладать способностью плавиться для обеспечения максимального контакта лекарственного вещества со слизистой оболочкой; при этом она должна быть достаточно твердой в момент введения суппозитория, чтобы преодолеть упругость мышц; иметь небольшой интервал между температурами плавления и застывания (1–2 îС), обладать достаточной вязкостью, отсутствием химического взаимодействия с лекарственными веществами, быть стабильной в процессе хранения, хорошо высвобождать лекарственные вещества [56]. Все компоненты суппозиторных основ удовлетворяют вышеуказанным требованиям.
В процессе работы нами проведена сравнительная оценка 7 вариантов суппозиторных составов. Для приготовления суппозиториев в каче-
69
стве активного вещества использовали ЧЛИ, синтезированный в суспензионной культуре донорских лейкоцитов. Разработанная нами технология получения ИФН описана в гл. 3. Полуфабрикат ИФН проверяли на стерильность, наличие регламентированного уровня противовирусной активности, отсутствие инфекционного вируса-индуктора, токсичности и неспецифических примесей, а также на отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита С (ВГС), антител к ВИЧ типа 1 и 2. Затем ИФН очищали от низкомолекулярных примесей гельфильтрацией на сефадексе Г-25 «грубый» с диаметром гранул 100–300 м, затем проводили микрофильтрацию и лиофильное высушивание. Исходная специфическая активность во всех образцах суппозиториев была одинаковая и равнялась 40000 МЕ/свече. В первом варианте в качестве основы сравнения использовали твердый кондитерский жир и эмульгатор Т-2 в количестве 5 % от массы свечей, во втором варианте – вышеуказанные компоненты с добавлением для увеличения точки плавления свечи, с третьего по седьмой варианты применяли марки жировой основы «Витепсол» Н-15 и W-35 в различных соотношениях.
Для приготовления первого варианта суппозиториев с ИФН использовали гидрофобную основу следующей комбинации: твердый кондитерский жир (tîïë 35 îС), парафин (tîïë 50–57 îС) и эмульгатор Т-2 (tîïë 35 îС). Для второго варианта, основываясь на физико-химических характеристиках указанных составляющих, в композиционный состав вводили парафин (для уплотнения консистенции основы) и эмульгатор, создавая условия для улучшения инкорпорирования жидкостей и учитывая, что температура плавления эмульгатора Т-2 лежит в диапазоне температур, при которых суппозиторную массу следует заливать в формы (39,0 1,0 îС). Однако оказалось, что в момент фасовки в лакированный целлофан суппозитории частично расплавлялись. В то же время основа такого состава вполне отвечает всем требованиям, предъявляемым к суппозиторным основам, имеет хорошие струк- турно-механические свойства, легко инкорпорирует водные растворы, химически, фармакологически индифферентна, а также легко высвобождает ИФН. Однако у твердых жиров выражен существенный недостаток – химическая нестабильность, проявляющаяся в процессе окисления жиров при хранении, в результате срок годности суппозиториев с интерфероном сокращается до 1 года, тогда как срок годности самого интерферона – 2 года.
70