Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

ГЛАВА 1 БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕХНОЛОГИИ

ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ

1.1. Интерфероны и их биологические свойства

Интерферон, являясь фактором естественной неспецифической защиты и медиатором иммунных реакций, уже много лет служит объектом исследовательского и практического интереса иммунологов, вирусологов и особенно врачей. Термин «интерферон» появился в научной литературе, посвященной проблемам вирусологии, 50 лет назад. В 1957 году А. Isaacs, J. Lindenman, изучая механизм интерференции при экспериментальной гриппозной инфекции, обнаружили, что этот феномен опосредован действием особого белкового фактора, обладающего антивирусными свойствами. Этот фактор вначале был получен при инфицировании вирусами развившихся куриных эмбрионов (КЭ) в хорионаллантоисные оболочки, а затем при воздействии различных вирусов и невирусных нуклеиновых кислот на клетки многих видов животных. Этот неизвестный ранее низкомолекулярный фактор был назван интерфероном (ИФН).

ИФН – низкомолекулярный гликопротеид, содержащий распространенные аминокислоты и небольшое количество углеводов, включая глюкозамин. В структуре ИФН существенное значение имеют дисульфидные связи. Изменение дисульфидных и гуанидиновых групп, а также остатков циклических кислот приводит к полной потере активности ИФН. В случае когда ИФН гликолизирован, потеряв углеродный остаток, или синтезирован в условиях, блокирующих гликолизирование, молекулы ИФН сохраняют в полной мере биологическую активность и расширяют спектр перекрестной активности. К настоящему времени известно более 20 ИФН человека. Они различаются по аминокислотному составу, степени гликолизирования, молекулярной массе, фармакологическим свойствам [32, 69]. Для каждого из них уникально и соотношение потенциала

11

биологических активностей. Все ИФН синтезируются клетками только в ответ на воздействие индуктора.

Среди многочисленных факторов, воздействие которых приводит к стимуляции интерферонообразования в культуре клеток или организме животного, химические и биологические препараты – индукторы интерферона – занимают ведущее положение. В качестве индуктора ИФН могут функционировать вирусные и синтетические нуклеиновые кислоты, митогены, антигены, опухолевые клетки, микроорганизмы и некоторые низкомолекулярные соединения, например катионные красители [96].

К настоящему времени сложилось представление о системе ИФН, которая кроме трех видов ИФН включает их гены, а также рецепторы [78]. Несмотря на наличие общих свойств и функций, они различаются по направленности и интенсивности действия. Различия между ИФН 1-го и 2-го типов достаточно глубоки. ИФН 1-го типа могут продуцироваться практи- чески всеми ядерными клетками, а также неиммунокомпетентными и малодифференцированными. В то же время продукция ИФН типа 2 является функцией иммунокомпетентных клеток и реализуется в процессе иммунного ответа. Помимо трех видов ИФН различают два типа. Индуцированные вирусами ИФН относят к типу 1: ИФН- и ИФН-. К типу 2 относят ИФН- , продуцируемый только после контакта Т-лимфоцитов со специфическими антигенами или митогенами. ИФН- (лейкоцитарный) продуцируется в основном моноцитами, гранулоцитами; ИФН- (фибробластный) экспрессируется фибробластными и эпителиальными клетками; ИФН- (иммунный) синтезируется только Т-лимфоцитами в кооперации с макрофагами [6;43;68].

ИФН- и ИФНблизки структурно, как правило, стабильны хими- чески и обладают выраженной способностью вызывать состояние невосприимчивости к вирусной инфекции [98]. ИФНсущественно отличается от них по химическим и биологическим свойствам. Для него характерна более замедленная кинетика развития состояния невосприимчивости к вирусной инфекции, но он обладает более высоким потенциалом антипролиферативного и иммуномодулирующего действия [28; 114]. Биологические эффекты ИФН обоих типов многообразны, но вместе с тем они не перекрываются, так как избыток одного типа ИФН не может функционально компенсировать отсутствие другого [107].

Совершенно особое место занимает недавно обнаруженный ИФН-2. Активными индукторами этого вида ИФН являются интерлейкин-1

12

(ИЛ-1), фактор некроза опухоли (ФНО) и даже ИФН. Противовирусная его активность проявляется в отношении узкого спектра клеток, удельная активность в 100 раз ниже, чем у ИФН-1, хотя по структуре молекулы они похожи. В силу того, что ИФН-2 обладает выраженными ростстимулирующими свойствами, его относят к ИЛ (ИЛ-6).

Недавно обнаруженный ИФНотносится к интерферонам типа 1, он синтезируется в очень короткий срок в начале беременности, играет важную роль в механизме материнского узнавания беременности и проявляет высокую антивирусную и антипролиферативную активность без цитотоксичности в культурах клеток in vitro [95].

ИФН-альфа имеет большое число индивидуальных компонентов с высокой степенью структурной гомологии – не менее 70%. Значение этого разнообразия до настоящего времени пока не объяснено. В процессе биосинтеза состав индивидуальных компонентов меняется в зависимости от индуктора и других условий среды. Главное свойство ИФН заключается в действии, подавляющем репродукцию вирусов и тем самым препятствующем развитию инфекционного процесса. Действие ИФН не ограничи- вается только вирусами, а распространяется также на другие внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии, простейшие), бактерии

èпродукты жизнедеятельности бактерий (токсины) [27;105]. Обладая, как

èантитела, противовирусной активностью, ИФН вместе с тем имеют

èряд характерных особенностей, которые позволяют дифференцировать их от антител. ИФН могут вырабатываться любыми клетками, антитела – только специализированными. ИФН способны подавлять внутриклеточно расположенные вирусные частицы, антитела связывают и нейтрализуют внеклеточно находящийся вирус. ИФН обладают видотканевой специфичностью, антитела – нет. ИФН вирусспецифичностью не обладают, антитела же обладают.

Продукция ИФНявляется наиболее быстрой реакцией организма на патоген: он выделяется макрофагом или другой антиген-представляющей клеткой (АПК) уже при первом контакте с антигеном и формирует невосприимчивость через активацию клеточных реакций намного раньше специфического, связанного с антителами иммунитета [4;50;51]. АПК активируются аутокринно, продуцируя ИФН- и ИЛ-6, а в процессе презентации антигена Т-лимфоцитам также продуцируют ИФН- в комплексе с другими цитокинами первой фазы иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО- , МИФ и ЛИФ), активируя таким образом Т-лимфоциты.

13

Интенсивная продукция цитокинов обеспечивает активацию эффек- торов-макрофагов, нейтрофилов, естественных киллеров (ЕК), их амплификацию в иммунном ответе. Кроме того, увеличивается координация соотношения ТН1/ТН2, которая определяет направление последующих иммунных реакций.

В настоящее время установлено, что в ходе вирусной инфекции происходит синтез не только ранее известного кислотостабильного ИФН, но и образуется кислотолабильный ИФН, выявленный и изученный в последние годы [82; 94]. Активными продуцентами кислотолабильного ИФНявляются В-лимфоциты и большие гранулярные лимфоциты, не обладающие активностью ЕК.

Указанные взаимодействия составляют основу неспецифического клеточного иммунитета и в реальной жизни протекают непрерывно, главным образом на уровне физиологических внешних барьеров (все слизистые оболочки, кожа, роговица глаза и др.). При этом отсутствуют какие-либо клинические симптомы [77].

В последнее время особое внимание уделяется иммуномодулирующей активности ИФН, которая выражается в способности влиять на рост, дифференцировку и функциональную активность различных эффекторных клеток иммунной системы. Биологические эффекты ИФН развиваются вследствие подавления или усиления некоторых клеточных синтезов и изменения свойств клеточных мембран [1].

Взаимодействие ИФН с клеткой осуществляется на уровне плазмати- ческой мембраны, после соединения с высокоспецифическими рецепторами. Видовая специфичность ИФН определяется структурой рецептора и может преодолеваться введением ИФН в липосомы [35, 36]. Количество рецепторов колеблется от нескольких десятков до нескольких тысяч. Их экспрессия на мембране является функциональным свойством и может подавляться при введении больших доз (выше 6 млн МЕ) интерферона человеческого лейкоцитарного, восстанавливаясь через 48 часов. Из этого следует исключительно важный практический вывод, что при массированных курсах интерферонотерапии введение препарата должно быть прерывистым, с интервалом между введениями не менее 48 часов. Это не имеет зна- чения при дозе 1–3 млн МЕ. Важно отметить, что эффективность интерферонотерапии зависит от всех компонентов системы ИФН [51].

Одно из наиболее изученных свойств ИФН – антивирусное действие, выражающееся в защите клетки от большинства ДНК- и РНК-содержащих

14

вирусов. Действие ИФН возможно только в гомологичных клеточных системах. Исследования показали, что механизм противовирусной активности различных типов ИФН неоднозначен. Так, ИФН - непосредственного действия на вирус не оказывает. На первом этапе происходит специфическая модификация клеточной мембраны. Воздействуя через мембранные рецепторы, ИФН активирует выработку ц АМФ и ц ГМФ, что приводит к синтезу новых внутриклеточных белков. Суммарно синтезируется около 25 ИФН-индуцируемых белков, функциональные свойства которых определяют спектр биологических активностей ИФН.

Среди белков, обладающих противовирусной активностью, наиболее изученными являются 21,51-олигоаденилатсинтетаза (ОАС) и РНК-зависи- мая протеинкиназа – факторы инициации синтеза белка. Протеинкиназа и ОАС обладают ферментативными активностями, однако до момента инфицирования клеток вирусами остаются в неактивном состоянии [7]. Под действием 21,51-олигоаденилатсинтетазы образуется на основе АТФ серия коротких полиаденилатов, соединенных необычной 21,51 диэфирной связью. Полиаденилаты являются мощным индуктором клеточной РНК-азы, которая расщепляет вирусную РНК. Протеинкиназа фосфорилирует один из факторов инициации синтеза белка 61Р2, что останавливает синтез вирусного белка. Взаимодействие 21,51-олигоаденилатсинтетазы и протеинкиназы эффективно предотвращает синтез компонентов вируса в клетке. Кроме того, по мнению некоторых авторов, противовирусная и другие активности ИФН могут передаваться от клетки к клетке путем прямой передачи 21,51-олигоаденилатов. Показано также, что ИФНобладает выраженным стимулирующим действием на синтез м РНК-1, в то время как вирус, в частности вирус Синдбис, заметно ингибировал м РНК-II. Косвенным подтверждением предполагаемых механизмов регуляции ИФН собственной экспрессии, объясняющих прайминг и блокинг стимуляцией 21,51-олигоадени- латсинтатезы и протеинкиназы, являются результаты математического моделирования [6].

Воздействие ИФНна эффекторные клетки иммунной системы не ограничено описанными выше реакциями. Оно значительно шире и реализуется на клеточном, тканевом или организменном уровнях. В физиологических условиях под действием ИФН усиливаются не только состояние невосприимчивости к вирусной инфекции, но и естественная и антителозависимая цитотоксичность лимфоцитов в отношении антигеноизмененных клеток, а также фагоцитарная активность макрофагов

15

и нейтрофильных гранулоцитов, стимулируется высвобождение гистамина базофилами, усиливается синтез простогландинов, происходит формирование антигенов гистосовместимости и реакции «хозяин против трансплантата», интерфероногенез [14;29;37;63]. Под действием ИФН подавляются рост, размножение, дифференцировка нормальных и опухолевых клеток, антителообразование (первичный и вторичный иммунный ответ), реакция гиперчувствительности замедленного типа, реакция «трансплантат против хозяина».

Все интерфероны обладают антивирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностями [30;69;81;87]. Все они регулируют разнообразные клеточные функции. Степень проявления этих активностей сильно варьирует в клетках разных типов. Так, ИФН- и ИФНподавляют размножение вирусов везикулярного стоматита и энцефаломиокардита сильнее, чем ИФН-, который, в свою очередь, подавляет размножение реовируса и вируса осповакцины сильнее, чем ИФН- и ИФН-. Проведенные исследования показывают, что по крайней мере в отношении некоторых вирусов для противовирусной защиты необходимо функционирование обеих систем интерферона. Причем избыток одного типа ИФН не может функционально компенсировать отсутствие другого. В отношении опухолевых клеток ИФНоказывает более сильное антипролиферативное действие по сравнению с ИФН- и ИФН-. Соотношение антипролиферативной и антивирусной активности ИФН зависит как от вида, так и от свойств клеточных тест-систем, на которых испытываются препараты.

Антипролиферативный эффект ИФН проявляется в дозозависимом торможении роста нормальных и опухолевых клеток. При этом действие ИФН типа 1 носит, как правило, цитостатический, то есть обратимый характер, тогда как действие ИФН- часто цитотоксично. Под влиянием ИФН происходит активация моноцитов/макрофагов. Они способны также подавлять рост и дифференцировку гемопоэтических клеток, повышают фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов. ИФН являются основными медиаторами цитолитической функции в организме. Так, все виды ИФН способны активировать естественные киллеры. Чувствительность ЕК к ИФН относят к генотипическим признакам, при этом она взаимосвязана с возрастными особенностями макроорганизма [80]. Активация ЕК достигается при системном введении ИФН, но при интенсивных курсах возможно развитие гипореактивности. ИФН активирует

16

К-клетки, осуществляющие цитолиз, опосредованный антителами. Под действием всех ИФН происходит усиление экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместмости (ГКГ) 1-го класса, а под действием ИФН- и ИФН- с цитокинами усиливается также экспрессия антигенов ГКГ 2-го класса.

Влияние ИФН на иммунную систему становится предметом все более детальных и интенсивных исследований. Имеются данные, что ИФН увеличивают активность естественных киллеров человека (особенно ИФН-), подавляют пролиферацию макрофагов из костного мозга, уменьшают индуцированное антигенами или митогенами подавление миграции лейкоцитов. Иммуномодулирующее действие ИФН реализуется через усиление экспрессии поверхностных антигенов, что исключи- тельно важно для распознавания измененных клеток, активации эффекторных клеток путем модулирования процессов их дифференцировки, созревания и пролиферации. Вместе с тем проведенные исследования показали, что антипролиферативная активность связана не только с самим ИФН, но и с биологически активными соединениями в нем. Так, сравнивая антипролиферативное действие одинаковых доз ИФНраз- личной степени очистки, некоторые авторы пришли к выводу о частич- ной утрате антипролиферативной активности в процессе глубокой очистки ИФН [72;78].

Многообразие перечисленных выше эффектов ИФН, включая иммуномодулирующий, противовирусный, антипролиферативный, антибактериальный и др., указывает на широкие контрольно-регуляторные функции этой системы, направленные в целом на сохранение гомеостаза.

Система ИФН осуществляет не только первую линию защиты организма от инфекций, но и участвует в дальнейших процессах уничтожения чужеродных объектов. Так, состояние системы ИФН обуславливает потенциальные возможности организма в борьбе с инфекциями. Исследуя ИФН-статус, можно определить функциональную активность не только системы ИФН, но и системы иммунитета, установить стадию и характер протекания заболевания. Изучая динамические изменения ИФНстатуса человека, можно делать достоверные прогнозы исхода заболевания. В понятие «интерфероновый статус» входят параметры, определяющие состояние системы ИФН: содержание различных типов ИФН в циркулирующей крови, способность лейкоцитов вырабатывать ИФН- и - при соответствующей индукции in vitro и ряд других показа-

17

телей. Интерфероновая реакция лейкоцитов (ИРЛ), характеризующая уровень резистентности организма и оценивающая продукцию ИФН вирусиндуцированными лейкоцитами, как правило, подавляется практиче- ски при любой патологии и точно отражает реакцию организма на вредные воздействия [18;37;53;114]. Наиболее простым и доступным суммарным показателем служит количественное определение ИФН

âсыворотке крови (сывороточный или циркулирующий ИФН). При обследовании здоровых лиц, в частности доноров крови, установлено, что

âподавляющем большинстве случаев (90%) титры циркулирующего ИФН не превышают фоновых значений (< 4 МЕ /мл), т.е. находятся

âпределах физиологических концентраций [29;31].

Другими показателями ИФН-статуса служат уровни продукции ИФН- и - лейкоцитами, индуцированными in vitro. У здоровых лиц в 80% случаев наблюдается высокий (более 1280 МЕ/мл) уровень продукции ИФН-, в основном у лиц с группой крови О (I), В (III) и АВ (IV), у лиц с А (II) группой крови имеется сниженная способность продукции ИФН и средний уровень продукции ИФН- (32 – 64 МЕ/мл). Адекватное лечение в первую очередь восстанавливает ИРЛ, что служит объективным показателем выздоровления. Кроме того, простота и дешевизна исследования ИФН-статуса позволяет широко использовать его в клинической практике для оценки характера протекания заболевания, своевременной коррекции методов лечения, определения показаний к применению тех или иных препаратов, прогнозирования исходов заболевания, уточнения диагноза [27;101].

Таким образом, широкий спектр противовирусного действия ИФН и его способность оказывать иммуномодулирующее действие и ингибировать размножение опухолевых клеток указывают на перспективность препаратов ИФН при профилактике и лечении и инфекционных, и онкологических заболеваний.

1.2. Современные аспекты технологии производства интерферона

Получение медицинских препаратов ИФН природного происхождения все ещ¸ остается достаточно сложной задачей. Видовая специфич- ность ИФН вынуждает проводить процесс его синтеза в культурах клеток человека. Но резерв этих клеток ограничен, они сложны в культиви-

18

ровании и всегда вызывают настороженность как потенциальные носители человеческих вирусов [49].

ИФН может продуцироваться как стандартными однослойными культурами, так и суспензионными культурами клеток. Принято счи- тать, что клетки во взвешенном состоянии более интенсивно продуцируют ИФН. Способностью синтезировать ИФН обладают как первичные, диплоидные, так и перевиваемые линии клеток фибробластного и эпителиального типов. Активными продуцентами ИФН являются также элементы белой крови человека и животных [48;70;71;91].

Первые сведения о лимфобластоидных клетках Namalva получены в 1972 году, когда J. Klein и соавторы успешно культивировали перевиваемую линию лимфоцитов В-типа, выделенную путем биопсии от больного лимфомой Б¸ркитта. Через три года Н. Strander и соавторы (1975) выяснили, что эти клетки лучше, чем многие другие, продуцируют ИФН под воздействием вируса Сендай. Ими были испытаны более 100 линий лимфобластоидных клеток на интерферонообразование и среди 13% положительных результатов определен наиболее оптимальный продуцент, которым оказались клетки Namalva. Технология получения интерферона на этой линии клеток интересна тем, что лимфобластоидный ИФН по своим свойствам очень близок к лейкоцитарному ИФН. При анализе ИФН, продуцируемого линией Namalva, показано, что около 85% ИФН относится к лейкоцитарному, продуцируемому лейкоцитами человека. Не менее 13% от общей активности относилось по антигенной структуре к фибробластному ИФН. Лимфобластоидный ИФН является дешевым источником ИФН для лечения онкологических больных, а также для биохимических исследований с целью расшифровки его структуры [3; 97;108].

Для получения фибробластного ИФН человека используют культуры диплоидных клеток, из которых наилучшими продуцентами являются диплоидные клетки крайней плоти человека. При культивировании они способны накапливаться в больших количествах, а для поддержания исходной диплоидной структуры в течение длительного времени их рекомендуется сохранять в атмосфере жидкого азота при температуре минус 70–85 oÑ.

Процесс биосинтеза ИФН-гамма является более продолжительным, чем биосинтез ИФН-альфа, хотя это в значительной мере зависит от используемого индуктора. Для классического индуктора ИФН- – стафило-

19

коккового энтеротоксина А оптимальный срок биосинтеза 72 часа. При этом наиболее эффективным способом культивирования клеток является роллерный при нагрузке 5 млн лимфоцитов в 1 мл питательной среды. Другие иммуногенные метаболиты стафилококка – энтеротоксин В, белок А также являются активными индукторами, но не нашли пока широкого применения в технологии получения ИФН- . Лишь в последнее время были определены оптимальные условия прайминга для данного вида ИФН: эффективная активация синтеза ИФНдостигалась либо высокими дозами ИФН- , либо низкими дозами ИФН- (1000 и 10 МЕ/ мл соответственно). Установлено также, что предварительная обработка суспензионных культур лейкоцитов периферической крови человека ЧЛИ в концентрации 1500 ед/мл повышает в 6–7 раз продукцию ИФН-, индуцированного конкавалином А [111]. Однако, более перспективным представляется использование коиндукторов – известных иммуностимуляторов – интерлейкина 2 или Т-активина.

Малодоступность и высокая стоимость природных препаратов ИФН ограничивают их широкое использование в клинической практике. Успешные исследования интерферонной матричной РНК и клеточной ДНК позволили расшифровать их нуклеокапсидную последовательность и осуществить химический синтез гена ИФН. В связи с этим появилась реальная возможность для массового получения препаратов рекомбинантного ИФН [39;40;115]. В настоящее время в клинической практике наиболее широкое применение получил препарат генно-инженерного ИФН- 2. Процесс получения рекомбинантного ИФН осуществляют следующим способом: культуры клеток лейкоцитов человека заражают вирусом и после синтеза ИФН из клеток выделяют РНК, на ней с помощью фермента ревертазы синтезируют ДНК. Из массы полученных молекул ДНК отбирают те, в которых закодирована информация об ИФН. Затем ДНК, несущую информацию об ИФН, включают в плазмиду (кольцевую ДНК) кишечной палочки. Тем самым бактерия обретает новое свойство вырабатывать ИФН, в большом количестве – до 2,5 108 ед. на 1 л культуры. В 80-х годах в литературе появились сообщения об удачных результатах клонирования в E. cîli генов – ИФН-, -, -. Таким образом, создание промышленного производства рекомбинантных ИФН открыло новые перспективы в клиническом изучении и применении этих крайне интересных биологических модификаторов иммунореактивности [106;113].

20