Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на

ГЛАВА 2 МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЕДИНОЙ

СИСТЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА

Âпоследние годы большое внимание уделяется совершенствованию технологии получения ИФН-. Рост потребности здравоохранения в этом препарате при дефиците донорского сырья – клеток-проду- центов (лейкоцитов) обуславливает необходимость поиска новых путей решения данной проблемы. В частности, активизируется поиск разнообразных способов повышения продукции ИФН лейкоцитами. По данным ряда авторов, на уровень образования ИФН могут влиять различные факторы: условия хранения лейкоцитов, качество индуктора, состав среды культивирования, е¸ белковые компоненты, условия биосинтеза и другие.

Âданной главе представлены материалы исследований, направ-

ленных на совершенствование методов синтеза природного ИФН-. В частности, это касается разработки условий повышения удельной противовирусной активности интерферона, а также оценки спектра цитокинов в препаратах ЧЛИ, синтезируемых в производственных условиях Пермского НПО «Биомед», с целью обоснования расширения показаний для его клинического использования.

2.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса Сендай

В настоящее время при получении интерферона человеческого лейкоцитарного в качестве интерфероногена, как правило, используют вакцинный штамм «Н» вируса болезни Ньюкасла, который является наиболее распространенным индуктором [52]. Однако вирус болез-

31

ни Ньюкасла, обладая высокими интерфероногенными свойствами, имеет и ряд отрицательных качеств: сильно выраженным повреждающим эффектом на лейкоциты, гемолитическим действием на остаточ- ные эритроциты, присутствующие в лейкоцитарной суспензии. Кроме того, с вируссодержащей жидкостью при индукции в полуфабрикат попадают белки аллантоисной жидкости куриного эмбриона, а также овальбумин[10].

Показано, что использование вируса Сендай в качестве индуктора интерфероногенеза позволяет не только получить препарат с высокой противовирусной активностью, но и уменьшить количество аллантоисных белков куриных эмбрионов, в том числе и овальбумина в готовом продукте.

Âсвязи с этим нами был проведен цикл исследований по изучению

èразработке параметров культивирования вируса Сендай в качестве интерфероногена в условиях крупномасштабного производства ИФН [11].

При работе с вирусом Сендай в качестве маркера инфекциозности вируса использовали его гемагглютинирующую активность в отношении куриных эритроцитов. Первоначально необходимо было изучить влияние состава среды для приготовления разведений маточного материала, используемого при культивировании вируса, на гемагглютинирующую активность репродуцируемого вируса Сендай. Куриные эмбрионы заражали вирусом Сендай с исходной активностью не менее 8000 ГАЕ/мл введением в аллантоисную полость инфицирующей дозы, равной 1,6 АГ в 0,2 мл. Рабочие разведения вируса Сендай готовили на 0,9%-ном растворе хлорида натрия со значениями рН 6,6 и 7,3

èфосфатном буферном растворе с рН 6,6 и 7,3 (табл. 1).

Как видно из табл. 1, наибольшая гемагглютинирующая активность регистрируется при разведении маточного материала вируса Сендай фосфатным буферным раствором с рН 7,3 – 8800,0 2191,0 ГАЕ/мл, по сравнению с таковой при использовании фосфатного буфера с рН 6,6 – 2800,0 489,9 ГАЕ/мл (р<0,05). Увеличение продукции вируса Сендай в развивающихся куриных эмбрионах отмечается также при разведении маточного материала 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,3, однако менее выраженное (2800,0 489,9 ГАЕ/мл против 1400,0 244,9ГАЕ/мл при рН 6,6).

По мнению ряда исследователей [103;104], существует обратная коррелятивная зависимость между степенью вирулентности вируса и его способностью индуцировать синтез интерферона. На модели различных вирусов пока-

32

зано, что штаммы со сниженной вирулентностью способны индуцировать синтез большего количества ИФН, чем высоковирулентные культуры вирусов. Эти данные подтверждены результатами исследований М.Н. Муллагуловой с соавторами (1999) [11]. Селекционированный ими холодоадаптированный штамм ВБН с низкой гемолитической активностью обеспечивает индукцию ИФН с противовирусной активностью 11000–14000 МЕ/мл.

Ò à á ë è ö à 1

Сравнительная оценка влияния раствора NaCl и ФБР на гемагглютинирующую активность аллантоисной культуры вируса Сендай

*р < 0,05 по отношению к раствору NaCl c рН 6,6; **р < 0,05 по отношению к рас-

твору NaCl c рН 7,3.

Нами проведены модельные опыты по оценке влияния длительного культивирования вируса Сендай при различных температурных режимах. В связи с этим инфицированные одинаковой дозой вируса Сендай куриные эмбрионы (КЭ) помещали в инкубаторы (рис. 1) при температурах 28, 32, 37, 40, 42 îС на 72 ч с периодическим проветриванием (3 раза в те- чение 24 часов).

В данных условиях линии культур вируса Сендай пассировали до 30-го пассажа. В табл. 2 приведены результаты исследований по оценке влияния различных температурных условий культивирования вируса Сендай на его гемагглютинирующую активность.

Рис. 1. Инкубатор для выращивания куриных эмбрионов

33

Ò à á ë è ö à 2

Оценка влияния значений температур культивирования вируса в куриных эмбрионах на его гемагглютинирующую активность

* р < 0,01;** р < 0,05 по отношению к исходному уровню каждой опытной группы.

По нашим данным, оптимальным значением для культивирования вируса, обеспечивающим наибольшую и стабильную гемагглютинирующую активность вируса, является температура 37 îС. При указанной температуре, начиная с 3-го пассажа, отмечается стабильное нарастание накопления возбудителя (9143,0 1143,0 ГАЕ/мл) и особенно выраженное на 5–6-м пассажах (54860,0 5902,0 и 41600,0 9600,0 соответственно). В тоже время, при температуре 32 îС на первом пассаже отмечается падение

34

гемагглютинирующей активности вируса Сендай (исходная активность составляет 8000 ГАЕ/мл), затем незначительное повышение ко второму пассажу и постепенное снижение гемагглютинирующей активности до 6,3 0,81 ГАЕ/мл к 10-му пассажу. Кроме того, отмечается негативное влияние температуры 28 îС на размножение вируса Сендай в клетках КЭ, в отличие от ВБН. По нашим данным, культивирование вируса при температуре выше 37 îС также негативно влияет на уровень его гемагглютинирующей активности. При этих температурах, начиная с 6-го пассажа, отмечается снижение гемагглютинирующей активности, и к 10-му пассажу таковая активность в аллантоисной жидкости уже не регистрируется.

При статистической обработке полученных данных отмечается достоверное уменьшение накопления вируса Сендай в КЭ при температуре инкубации 28 îС, по сравнению с таковой при 32 и 37 îС (р > 0,05). При этом увеличение продукции вируса Сендай в КЭ отмечается при температуре 37 îС в сравнении с 32 îС (р > 0,05). Начиная с 4-го пассажа, отме- чается статистически достоверное увеличение продукции вируса Сендай при температуре культивирования 37 îÑ.

Таким образом, оптимальной температурой, способствующей максимальной репродукции вируса Сендай, являлась температура, соответствующая 37 îС. В связи с этим в качестве посевного материала вируса Сендай мы использовали вируссодержащую жидкость от 5–6-го пассажа, которая сохраняла активность в течение 6 месяцев при температуре 6–8 îÑ.

Известно, что на размножение вируса Сендай в развивающихся куриных эмбрионах могут влиять различные добавки, вносимые в куриный эмбрион как в качестве стабилизаторов, так и активаторов накопления вируса.

Для повышения накопления вируса Сендай в куриных эмбрионах использовали следующие растворы: 1% раствор желатина, 10% раствор альбумина из сыворотки крови человека, а также сахара – мальтоза, глюкоза, лактоза, позитивный эффект от применения которых был зарегистрирован в результатах экспериментов, проведенных М.Н. Муллагуловой (1999) с вирусом ВБН-Х-32/19.

Для оценки влияния вышеуказанных веществ маточный материал вируса Сендай разводили в фосфатном буферном растворе рН 7,3 с таким рас- четом, чтобы инфицирующая доза вируса была не менее 4 ГАЕ/0,2 мл для куриного эмбриона. В ходе всего эксперимента инфицирующая доза вируса Сендай была равнозначной, при этом варьировали только наполнители, которые вносили в посевной материал в конечной концентрации 1%. Контро-

35

лем служили КЭ, инфицированные той же дозой вируса, не содержащие добавок. Для проведения эксперимента использовали одну и ту же партию куриных эмбрионов. Из материалов, представленных в табл. 3, видно, что при внесении в куриный эмбрион вируса Сендай вместе с добавками репродукция его увеличивается в два раза при использовании глюкозы и желатина, и в 2,3–3,4 раза при применении таких олигосахаридов, как мальтоза, лактоза или сахароза. Необходимо отметить, что в присутствии лактозы репродукция вируса Сендай в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов значи- тельно больше, в 1,3 раза по сравнению с сахарозой, и в 1,5 раза по сравнению с мальтозой.

Следующим этапом наших исследований являлось изучение интерферониндуцирующей активности полученных вариантов вируса Сендай при воздействии их на донорские лейкоциты. Полученные интактные лейкоциты в концентрации 20 млн клеток/мл питательной среды обрабатывали в соответствии с регламентированным методом не инактивированным препаратом ЧЛИ, взятом в дозе 100 МЕ/мл, в присутствии 40 ЕД/мл инсулина в течение 2,5 часов в условиях суспензионного культивирования. Скорость перемешивания клеточной суспензии составляла 25 об/мин (рис. 2).

Ò à á ë è ö à 3

Оценка влияния различных добавок на гемагглютинирующую активность вируса Сендай при использовании равнозначной инфицирующей дозы вируса для куриных эмбрионов

*р<0,05 по отношению к контролю.

Затем единый праймированный пул клеток делили на 16 квот с концентрацией донорских лейкоцитов на мл питательной среды, равной 4 млн, и индуцировали вирусом Сендай, в дозах, указанных в табл. 4. Синтез ИФН

36

проходил во всех исследуемых вариантах в одинаковых условиях – суспензионное культивирование со скоростью перемешивания не более 25 об/мин при температуре 37,0–37,5 îС. Повторность всех опытов 5-кратная.

Как следует из данных, представленных в табл. 4, не выявлено корреляционной зависимости между уровнем противовирусной активности интерферона, продуцируемого лейкоцитами, и использованной дозой интерфе- роногена-вируса Сендай. По нашим данным, в равнозначных условиях культивирования донорских лейкоцитов введение малых доз

вируса позволяет получать ИФН с достаточно Рис. 2. Роллерная установка

ногена способствовует увеличению синтеза ИФН в том случае, когда используется в качестве растворителя ФБР с добавлением сахарозы или лактозы для приготовления маточного материала вируса Сендай.

Ò à á ë è ö à 4

Оценка продукции интерферона праймированными лейкоцитами при индукции различными дозами вируса Сендай, репродуцированного в присутствии различных добавок

37

*р < 0,05 по отношению к группе контроля с дозой индуктора 15 ГАЕ/мл; **р < 0,05 по отношению к минимальному количеству ГАЕ/мл, используемому внутри каждой опытной группы.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами определены оптимальные условия репродукции вируса Сендай при культивировании в развивающихся куриных эмбрионах, а именно: разведение маточного материала в фосфатном буферном растворе рН 7,3 в присутствии лактозы или сахарозы в конечной концентрации 1 % .

2.2. Оптимизация методов очистки и концентрации вируса Сендай

Известно, чем меньше по объему внесено индуктора в виде вируссодержащей аллантоисной жидкости с достаточно высоким интерферониндуцирующим действием в лейкоцитарную суспензию, тем меньше ксеногенных белковых компонентов будет содержаться в синтезируемом ИФН. В настоящее время предложены различные методы очистки и концентрации вирусов, в частности описаны методы очистки и концентрации вируса болезни Ньюкасла с помощью ультрацентрифугирования, ультрафильтрации, фракционирования на колонке с сефадексом G –75, с использованием гидроокиси цинка [13; 20; 23; 60; 66].

В то же время проанализированные нами доступные литературные источники не содержали аналогичных данных о вирусе Сендай. В связи с этим мы провели исследования по разработке оптимальных методов

38

очистки и концентрации вируса Сендай применительно к условиям крупномасштабного производства ИФН.

На первом этапе нами изучалась возможность очистки вируса Сендай с помощью дифференциального ультрацентрифугирования, при котором обеспечивалось бы максимальное оседание вирионов с минимальным разрушением последних. Основываясь на данных литературы о том, что полная седиментация вируса болезни Ньюкасла достигается центрифугированием при 15000 об/мин в те- чение одного часа, а также учитывая больший размер и выраженный полиморфизм вируса Сендай, нами были опробованы различные скорости осаждения вируса:

6000 об/мин, 10000 об/мин, 12500 об/мин в течение 1 ч, с использованием центрифуги марки Sorval (USA). Предварительно проводили осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) с помощью центрифугирования со скоростью 1200 об/мин в те-

чение 30 мин на центрифуге РС6–6 (рис. 3). Рис. 3. Центрифуга ÐÑ-6 Качество концентрации ВАЖ оценивали по

уровню гемагглютинирующей активности как надосадочной жидкости (объ- ¸м 100 мл), так и получаемых осадков вирионов, ресуспендированных в объеме ФБР рН 7,3, соответствующем 1/10 первоначального объема. В табл. 5 представлены данные по сравнительной оценке степени концентрации вируса Сендай при различных скоростных режимах центрифугирования.

Как видно из табл. 5, ультрацентрифугирование ВАЖ при скорости 12500 об/мин способствует оседанию большего числа вирионов из надосадочной жидкости, достоверно увеличивая при этом уровень гемагглютининов в осадках по сравнению с исходной взвесью вируса. При скорости 10000 об/мин отмечается значительное увеличение гемагглютинирующей активности, определяемой в осадках, в то время как в надосадочной жидкости отмечается их резкое уменьшение. При высоком гравитационном поле центрифугирования образуется очень плотный труднорастворимый осадок. Так, при центрифугировании ВАЖ при скоростях 6000 об/мин и 10000 об/мин в надосадочной жидкости регистрируется снижение уровня гемагглютининов, а при скорости 12500 об/мин – значительное их увеличение (р < 0,05). Сравнительный анализ показателей гемагглютинируещей активности ВАЖ

39

в различных режимах центрифугирования показал, что ни одно из опробованных условий не гарантирует максимальной степени концентрирования вируса Сендай.

Ò à á ë è ö à 5

Оценка степени концентрации вируса Сендай при различных скоростных режимах центрифугирования

*р <0,05 по отношению к исходному уровню гемагглютинирующей активности ви-

руссодержащей аллантоисной жидкости.

Таким образом, наибольшая концентрация вируса Сендай в осадке при наименьшей гемагглютинирующей активности надосадочной жидкости достигалась при центрифугировании ВАЖ при 10000 об/мин в те- чение одного часа по отношению к исходной ВАЖ (9280 ГАЕ/мл против 11200 ГАЕ/мл, р<0,05).

40