20. Культивирование вирусов, методы их обнаружения и идентификации. Культуры клеток и их характеристика.

Вирусы - строгие внутриклеточные паразиты, поэтому их можно выращивать только в живых клетках,не растут на искусственных питательных средах. Биологические модели для культивирования: лабораторные животные,развивающиеся куриные эмбрионы,(самый доступный,но не все вирусы),культуры клеток

Лабораторные животные: белые мыши (для вирусов гриппа, Коксаки), кролики (вирус бешенства),хомяки,обезьяны. Индикацию, то есть обнаружение вируса, проводят на основании развития типичных признаков забо­левания и изменений органов животного.ограничено из-за невосприимчивости животных многих вирусов.

Куриные эмбрионы (зародыш курицы в яйце 5-12 ней)

Преимущества метода: стериль­ность и отсутствие скрытых вирусных инфекций, возможность полу­чения вирусов в больших количествах, простота техники работы,немного времени. В зависимости от цели и от вида вируса материал вносят на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, желточный мешок, амниотическую полость. Индикацию вирусов проводят по характеру колоний вируса на хорион-аллантоисной оболочке. В аллантоисной жидкости вирусы обнаруживают по реакции гемагглютинации. Эта реакция основана на способности вируса гриппа и некоторых других вирусов агглютинировать (склеивать) куриные эритроциты.

Культура клеток - это клетки из органа животного или человека, которые живут и размножаются вне организма на искусств. питательной среде (в среде 199 или в среде Хенкса). Культивирование в культуре кле­ток - один из наиболее распространенных методов в вирусологии. Чаще всего применяются однослойные культуры клеток, прикрепленные к стенкам пробирок или плоских флаконов. Культуры клеток из эмбриональных и опухолевых тканей,более активны способны к росту и размножению Различают несколько типов культур.

1)неперевиваемые= первично-трипсинизированные(размножаются однократно) которые получают, обрабаты­вая трипсином исходную ткань, например, почки зеленых мартышек, или эмб­риональную ткань человека+раствор хенкса+флаконы корела горизонтально(1 слой получить),подсчет клеток в камере Горяева и термостат

2) перевиваемые культуры клеток способны размножаться при мно­гократных посевах на свежие питательные среды. Они могут под­держиваться в лаборатории путем постоянных пересевов в течение десятков лет(раковые клетки или нормальные клетки зародыша). Во многих лабораториях применяются перевиваемые куль­туры, полученные из раковой ткани человека: HeLa, ИЕр-2 и др.

Линии HELA –клетки карциномы шейки матки

Линии HEP2- клетки онко гортани

Линия детройт-6-клетки из костного мозга человека,больного раком легких

Линии а0 и а1-клетки аниона человека

Линия соц-клетки сердца обезьяны циномольгус

3) полуперевиваемые культуры клеток - это, например, диплоидные клетки из фибробластов человеческого эмбриона, способные размно­жаться в течение 40-50 пассажей (пересевов), сохраняя исходный диплоидный набор хромосом.диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим отлич от опухолевых

Признаки размножения вирусов в культуре клеток:

• Вирусы в культуре клеток обнаруживаются по цитопатическому действию (ЦПД), которое вы­зывают многие вирусы, например, вирус полиомиелита. ЦПД прояв­ляется в дегенерации и разрушении клеток, или в формировании мно­гоядерных клеток. Лизис клеток,где репродуцируется вирус,видимые под микроскопом морф изменения

• Включения-скопления вирусных частиц,белков.Тельца бабеша-негри при бешенстве,тельца варне-натуральная оспа

• Бляшки=негативные колонии вирусов

• реакция гемадсорбции-способность клеточных культур ,зараженнеы вирусом,адсорбировать на своей поверхности эритроциты!!!!!!!!!!!!!!только поверхностные АГ гемагглютинин-выявляется не любой вирус

• Цветная реакция-разница в цвете индикатора(полиемиелит) Если репродукция вирусов-цвет первоначальный,нарушается нормальный етаболизм,а непораженные вирусом-смена красного на желтый

• Иммунофлюоресцентный метод.

• Реакция связывания комплемента.

• Реакция гемагглютинации.

• Реакция преципитации в агаре.

• Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.

Методы определения вида и типа вирусов

Определение вида и типа вирусов в вируссодержащем материале производится путём нейтрализации вирусов специфическими сыворотками. Результат нейтрализации может быть установлен на основании следующих признаков:

1) нейтрализация ЦПД;

2) нейтрализация гемадсорбции;

3) задержка (торможение) гемагглютинации;

4) цветная проба;

5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием специфических флюоресцирующих сывороток;

6) нейтрализация в опыте на животных (у опытных животных инфекция не развивается).