17. Культивирование бактерий. Питательные среды: классификация и характеристика (простые, сложные, элективные, дифференциально-диагностические).

Культивирование – выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии размножаются только в организме животного или живых клетках.

Культуральные свойства микроорганизмов: 1)условия необходимые для размножения, 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства – одна из характеристик, которые учитываются при определении вида.

Условия культивирования:

1. Наличие полноценной питательной среды. Каждая питательная среда независимо от сложности состава и цели применения (гл. 2) должна обладать водной основой, органическим источником углерода и энергии, определенным pH, осмотическим давлением.

2. Температура культивирования. Температура влияет на скорость размножения. К температуре бактерии относятся по-разному:

— мезофилы размножаются в диапазоне температур 20-40 °С. К мезофиллам относится большинство болезнетворных для человека бактерий;

— термофилы растут в диапазоне температур 40-60 °С. К термофилам относятся актиномицеты, некоторые спороносные бациллы;

— психрофилы размножаются в диапазоне температур 0—20 °С.

3.Атмосфера культивирования. Для роста и размножения строгих аэробов необходим кислород. Аэробы хорошо растут на поверхности агара на чашках Петри или в тонком верхнем слое жидкой среды. Для обеспечения роста и размножения строгих аэробов в глубинных слоях жидкой среды необходимо диффузное распределение кислорода по всему объему питательной среды. Это достигается непрерывным перемешиванием или встряхиванием питательной среды.

Для культивирования факультативных анаэробов используют те же методы, так как в присутствии кислорода у них преобладает оксидативный метаболизм над ферментацией, как наиболее энергетически выгодный.

Микроаэрофилы размножаются при пониженном парциальном давлении кислорода. Этого можно достичь повышением в атмосфере культивирования парциального давления СО2 до концентрации 1—5 % против 0,03 % СО2 в атмосфере воздуха. Для этих же целей используют специальные СО2-инкубаторы, или же посевы помещают в эксикаторы, в которых устанавливают горящую свечу.

Облигатные анаэробы для своего роста и размножения требуют исключения доступа кислорода воздуха. Это достигается следующими мерами: — добавлением к питательным средам редуцирующих кислород веществ; тиогликолевой кислоты, аскорбиновой кислоты, цистеина, сульфидов; — регенерацией от кислорода воздуха жидких питательных сред путем их кипячения с последующим плотным закупориванием сосудов, в которые налиты среды, резиновыми пробками; — использование поглотителей кислорода, щелочного пирогаллола, и других, помещая их в герметически закрываемые емкости «газ- паки». Этот метод используется для культивирования аэротолерантных бактерий; — механическим удаление кислорода - используют анаэростаты и анаэробные боксы.

Для культивирования хемо- и фотоавтотрофных бактерий создается атмосфера, насыщенная CO2.

4. Время культивирования. Зависит от времени генерации. Больщинство бактерий культивируют для получения видимого роста в течение 18—48 ч. Для культивирования возбудителя коклюша требуется 5 суток, а для культивирования М. tuberculosis — 3-4 недели. 5. Освещение. Для выращивания фототрофных микроорганизмов необходим свет. Некоторые условно-патогенные микобактерии в зависимости от освещенности образуют пигмент, что используется при их идентификации.

Классификация сред:

По происхождению среды подразделяются на естественные, искусственные и синтетические. К естественным питательным средам относятся натуральные продукты животного или растительного происхождения – молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовятся по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.

По составу среды делятся на простые и сложные. К простым средам относятся такие, как мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ). Сложные среды в своём составе содержат различные дополнительные компоненты, необходимые для роста микроорганизмов.

По консистенции среды подразделяют на жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физико-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена в микробиологической промышленности. Полужидкие среды обычно используют для длительного хранения культур. Они содержат в своём составе 0,5-0,7% агар-агара, который в настоящее время используют в качестве уплотнителей для питательных сред. Агар-агар представляет собой полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при 100⁰С и уплотняющийся при 45⁰С и ниже. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. Плотные среды, содержащие 1,5-2% агар-агара, применяются для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, количественного учёта, определения антагонистических свойств и других целей. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.

Питательные среды по целевому назначению могут быть разделены на основные, специальные, элективные и дифференциально-диагностические. Основные питательные среды: мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар. Специальные питательные среды применяются для выращивания тех микробов, которые не могут расти на основных средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка. Элективные питательные среды применяются для выделения одного какого-либо вида микроорганизма из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растёт на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; а рост других бактерий задерживается. Например, свёрнутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочек брюшного тифа, солевые среды для стафилококка. Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других на основании их биохимических свойств. В этих средах в качестве основы применяют разнообразные органические и неорганические соединения: питательный бульон или 1% пептонную воду. К ним добавляют углеводы, спирты, мочевину и другие вещества; при расщеплении которых происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону, что изменяет цвет индикатора, также входящего в состав среды.

Дифференциально-диагностические среды делят на 4 основные группы:

1. Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов и токсинов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств: кровяной агар (КА), среда с желатином, молоко, желточно-солевой агар (ЖСА).

2. Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты и индикаторы: ферментативное расщепление субстрата приводит к сдвигу рН и изменению окраски индикатора. Например, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среды Гисса, среда Олькеницкого.

3. Среды для дифференциации микробов по редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красителями, обесцвечивающимися при восстановлении, а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий.

4. Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее распространёнными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.