Лекция 8

Молекулярные основы наследственности. Кодирование генетической информации в клетке. Реализация биологической информации. Транскрипция. Процессинг первичных транскриптов.

В первой главе была представлена макромолекулярная организация ДНК. Было показано, что ДНК является носителем наследственной (генетической) информации у всех эукариот и прокариот. Было отмечено, что функциональной единицей генетической информации является ген - последовательность нуклеотидов в ДНК, в которой содержится информация о последовательности аминокислот полипептидной цепи белка, либо о нуклеотидной последовательности какого-либо вида РНК. В этой главе будут рассмотрены следующие вопросы:

1) каким образом закодирована генетическая информация в ДНК (генах);

2) как реализуется генетическая информация, находящаяся в ДНК (генах) в признаки;

3) механизмы регуляции процесса реализации генетической информации.

Кодирование генетической информации

Исходя из основной формулы функции гена: ДНК (ген) → РНК → белок → признак, развитие признака организма связано, как правило, с образованием специфического белка. Специфичность белка определяется его первичной структурой, последовательностью аминокислот в полипептидной цепи белка. Это обеспечивается информацией, заложенной в ДНК (гене) в последовательности нуклеотидов. Принцип записи генетической информации о последовательности аминокислот в полипептидной цепи белка через последовательность нуклеотидов в ДНК или матричной РНК называется генетическим кодом. Генетический код был полностью расшифрован в 60-х годах ХХ столетия. Он имеет определенные свойства:

- генетический код триплетен. Это означает, что положение одной аминокислоты в полипептидной цепи кодируется последовательностью из трех нуклеотидов. Если каждой аминокислоте соответствует сочетание из 3-х нуклеотидов, то из четырех нуклеотидов молекулы ДНК можно составить 64 (4³) сочетания. Это более чем достаточно для кодирования 20 аминокислот;

- универсален - все живые организмы ( эукариоты, прокариоты и вирусы) используют один и тот же код. Исключением являются минорные отклонения в генетическом коде митохондрий, хлоропластов, микоплазмы, ресничных простейших;

- вырожден - положение аминокислот кодируется более чем одним триплетом (за исключением метионина и триптофана). Триплеты, которые определяют одну и ту же аминокислоту, называются триплетами-синонимами;

- не перекрывается - один и тот же нуклеотид не может одновременно относится к двум соседним триплетам;

- без запятых - не содержит каких-либо незначащих оснований между отдельными триплетами;

- специфичен - конкретный триплет кодирует только одну аминокислоту.

Обычно генетический код представлен в виде кодонов и(м)РНК. Все кодоны используются в белковом синтезе: 61 кодон кодирует 20 аминокислот; 3 кодона являются терминирующими (стоп-кодоны: УАА, УАГ, УГА). Между последовательностью нуклеотидов в и(м)РНК и кодируемой последовательностью аминокислот в полипептиде существует линейное соответствие (коллинеарность).

Табл. 1. Генетический код: аминокислоты и кодирующие их триплеты (кодоны) в и(м)РНК

Аланин	Аргинин	Аспарагин	Аспарагиновая кислота	Валин
ГЦУ, ГЦА, ГЦЦ, ГЦГ	ЦГУ, ЦГА, ЦГЦ, ЦГГ	ГАУ, ГАЦ	ААУ, ААЦ	ГУУ, ГУЦ, ГУА, ГУГ
Гистидин	Глицин	Глутамин	Глутаминовая кислота	Изолейцин
ЦАУ, ЦАЦ	ГГУ, ГГА, ГГЦ, ГГГ	ГАА, ГАГ	ЦАА, ЦАГ	АУУ, АУА, АУЦ
Лейцин	Лизин	Метионин	Пролин	Серин
УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУГ, ЦУЦ, ЦУА	ААА, ААГ	АУГ	ЦЦГ, ЦЦЦ, ЦЦА, ЦЦУ	АГУ, АГЦ, УЦА, УЦГ, УЦУ, УЦЦ
Тирозин	Треонин	Фенилаланин	Триптофан	Цистеин
УАУ, УАЦ	АЦУ, АЦА, АЦГ, АЦЦ	УУУ, УУЦ	УГГ	УГУ, УГЦ
НЕТ аминокислоты (стоп-кодон)
УАА, УАГ, УГА

Реализация генетической информации

В процессе реализации генетической информации можно выделить четыре основных этапа:

1) транскрипция;

2) процессинг первичных транскриптов;

3) трансляция;

4) посттрансляционные изменения белка.

Транскрипция

Несмотря на то, что информация о последовательности аминокислот в полипептидной цепи белка закодирована и хранится в ДНК (генах), сама ДНК не может служить матрицей в белковом синтезе. Генетическая информация, закодированная в ДНК (генах), передается на РНК, а последняя, выполняя роль посредника, переносит информацию к месту синтеза белка, где она реализуется в виде определенной последовательности аминокислот в белке. Таким образом, наследственная информация, закодированная в нуклеотидной последовательности, переводится в аминокислотные последовательности белков. Все это описывается центральной догмой молекулярной биологии, сформулированной Ф. Криком:

ДНК	→	РНК	→	белок
	транскрипция		трансляция

Стрелки указывают направление переноса генетической информации.

Таким образом, РНК является посредником в передаче наследственной информации. Такую РНК называют информационной или матричной РНК - и(м)РНК. Процесс переноса генетической информации от ДНК к РНК получил название транскрипция. Другими словами, транскрипция - это синтез РНК на ДНК как на матрице с переписыванием генетической информации.

Синтез белка на матрице информационной РНК получил название - трансляция. Трансляция - это процесс декодирования и(м)РНК, в результате которого информация с языка последовательности нуклеотидов и(м)РНК переводится на язык аминокислотной последовательности белка. Таким образом, генетическая информация реализуется в результате двух последовательных процессов - транскрипции и трансляции. Реализацию генетической информации, закодированной в ДНК, путем транскрипции и трансляции и(м)РНК, определяют как экспрессию гена. Экспрессия имеет место при активном функционировании гена, когда идут процессы транскрипции и трансляции.

Итак, транскрипция - процесс синтеза РНК на полинуклеотидной цепи двойной спирали ДНК. Полинуклеотидная цепь ДНК, которая будет являться матрицей при образовании РНК называется матричной цепью (антисмысловой). Образовавшаяся РНК в процессе транскрипции соответствует по своей нуклеотидной последовательности другой нематричной (смысловой) цепи ДНК, на которой и расположены гены. Для осуществления транскрипции необходимо, кроме ДНК-матрицы, наличие пула нуклеотидов в форме трифосфатнуклеотидов и фермента РНК-полимеразы. В процессе транскрипции участвует также много белков-помощников (транскрипционные факторы).

РНК-полимераза имеет некоторые особенности по сравнению с ДНК-полимеразой. Во-первых, РНК-полимераза сама расплетает ДНК. Во-вторых, РНК-полимеразе не требуется затравка для начала синтеза РНК. В-третьих, у РНК-полимеразы нет корректирующей активности.

Транскрипция - это матричный процесс, в котором выделяют стадии инициации, элонгации и терминации. Начинается транскрипция после присоединения РНК-полимеразы к специфической нуклеотидной последовательности ДНК перед геном - промотору.

В структуре эукариотического промотора гена, транскрибируемого в и(м)РНК, выделяют нуклеотидные последовательности: ТАТА-бокс и последовательность ЦААТ. ТАТА-бокс - это базовая часть промотора, ЦААТ - дополнительная часть промотора. Эти последовательности узнают транскрипционные факторы (специфические белки), связываются с ними и позиционируют РНК-полимеразу в области промотора, что обеспечивает ее связывание с промотором. Особую роль в этом играет базовая часть промотора - ТАТА-бокс. Промотор отмечает в ДНК то место, с которого должен начаться синтез РНК. Именно ТАТА-бокс служит для точной ориентации РНК-полимеразы II при синтезе и(м)РНК относительно первого транскрибируемого нуклеотида. Присоединившись к промотору, РНК-полимераза расплетает участок спирали ДНК, обнажая участок одноцепочечной ДНК, который будет служить матрицей для синтеза РНК, и со стартовой точки начинается синтез. Стартовой точкой называют первое азотистое основание, с которого начинается транскрипция и обозначают ее +1. РНК-полимераза, продвигаясь шаг за шагом вдоль ДНК, раскручивает перед собой спираль ДНК, обнажая всякий раз новый участок матрицы для комплементарного спаривания оснований. Добавляя к растущей цепи РНК по одному нуклеотиду, РНК-полимераза постепенно наращивает эту цепь в направлении 5`→3`. Позади молекулы РНК-полимеразы немедленно восстанавливается двойная спираль ДНК. Все это соответствует стадии элонгации.

Процесс удлинения цепи РНК продолжается до тех пор, пока фермент не встретит на своем пути еще одну специфическую нуклеотидную последовательность в цепи ДНК - сигнал терминации транскрипции (стоп-сигнал). Достигнув этой точки, РНК-полимераза отделяется от матричной ДНК и новой синтезированной цепи РНК. Каждая завершенная цепь РНК отделяется от ДНК-матрицы в виде свободной одноцепочечной молекулы.

При транскрипции ДНК транскрибируется только одна из двух цепей. Образовавшаяся при этом РНК соответствует по своей нуклеотидной последовательности другой, нематричной (смысловой) цепи ДНК (за исключением того, что вместо тимина, присутствующего в ДНК, в РНК стоит урацил). Какая из двух цепей ДНК будет транскрибироваться определяется промотором. Поскольку цепи РНК растут лишь в направлении 5`→3`, именно от промотора зависит выбор цепи ДНК для транскрипции, поэтому разные гены могут считываться с противоположных цепей. Даже у двух соседних генов нередко транкрибируются разные цепи ДНК. Вместе с тем, в каждом данном гене транскрибируется лишь одна цепь.

Последовательность ДНК, транскрибируемая в одну молекулу РНК, получила название транскриптон (транскрипционная единица). У эукариот транскриптон включает как собственно информативную часть, так и последовательности, необходимые для инициации, элонгации, терминации и регулирования образования РНК.

Транскрипция - это процесс синтеза и(м)РНК, рРНК, тРНК и разных малых РНК. У прокариот все виды РНК синтезируются одним - единственным ферментом этого типа. У эукариот для транскрипции используется 3 разных фермента: РНК-полимераза I, II и III. Но только одна из трех, а именно РНК-полимераза II, транскрибирует гены, которые будут транслироваться в белки, то есть синтезирует и(м)РНК. Отдельные РНК-полимеразы эукариот узнают в последовательности ДНК различные сигнальные участки, «свои» промоторы, инициирующие синтез РНК, чем объясняется транскрибирование ими разных генов и синтез разных видов РНК. РНК-полимераза II, кроме синтеза и(м)РНК, синтезирует малые ядерные (мя)РНК, микро(мк)РНК, малые интерферирующие (ми)РНК и другие малые РНК. РНК-полимераза I синтезирует рРНК (5,8SрРНК, 18SрРНК, 28SрРНК). РНК-полимераза III синтезирует все тРНК, 5SрРНК, мяРНК и другие малые РНК.

Молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции участка ДНК, называется транскрипт. Совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой, включая кодирующие и(мРНК) и не кодирующие РНК, получила название транскриптом.

На приведенном выше описании транскрипции не заканчивается образование и(м)РНК у эукариот. Эукариотические транскрипты часто содержат длинные вставки некодирующих последовательностей (интроны), поэтому, образующаяся в результате транскрипции РНК превышает размеры информативной части гена. В результате транскрипции образуются первичные транскрипты - предшественники и(м)РНК (пре-и(м)РНК) или незрелые и(м)РНК.

Такие пре-и(м)РНК не могут выполнять свои функции. Процесс формирования зрелых молекул и(м)РНК из первичных транскриптов получил название процессинг первичных транскриптов. Процессинг пре-и(м)РНК – это совокупность биохимических реакций в результате которых происходит модификация пре-и(м)РНК с образованием зрелых молекул и(м)РНК: структурная (уменьшается молекулярная масса) и химическая.

Процессинг пре-и(м)РНК можно рассматривать как компонент центральной догмы молекулярной биологии:

ДНК	→ пре-и(м)РНК →	и(м)РНК	→	белок
	Транскрипция процессинг		трансляция

Процессинг матричной РНК у эукариот из пре-мРНК происходит в ядре и включает следующие этапы:

- кэпирование 5`- концевой области;

- процессинг 3` - концевой области;

- удаление интронов и соединение экзонов (сплайсинг).

Кэпирование 5`-концевой области

Сразу после транскрипции РНК-полимеразой II более 20 первых нуклеотидов происходит кэпирование первичного транскрипта путем присоединения к 5`-концу пре-и(м)РНК 7-метилгуанозина (метилированный остаток ГТФ). Метилгуанозин при этом связывается 5`-5`-фосфодиэфирной связью (а не 3`- 5`) с первым нуклеотидом пре-и(м)РНК (обратная ориентация). Это защищает транскрипт от разрушения его 5`-экзонуклеазой. Кэпирование имеет важное значение:

- обеспечивает эффективную дальнейшую транскрипцию;

- защищает транскрипт от деградации 5`-экзонуклеазами (благодаря 5`- 5` связи);

- способствуют дальнейшему ходу процессинга: стимулирует 3`-полиаденилирование и сплайсинг;

- требуется для экспорта и(м)РНК из ядра;

- обеспечивает связывание и(м)РНК с рибосомой в цитоплазме.

Процессинг 3`-области пре-и(м)РНК

Процессинг 3`- конца осуществляется путем расщепления и полиаденилирования (добавления полиА-«хвоста»). Полиаденилирование начинается после расщепления эндонуклеазами 3`-конца пре-и(м)РНК, где находится сигнал полиаденилирования – последовательность ААУААА. Специальная эндонуклеаза узнает эту последовательность и отрезает 10-30 нуклеотидов от пре-и(м)РНК. Затем фермент поли(А)-полимераза добавляет 100-200 адениловых нуклеотидов к 3`-концу транскрипта, формируется полиА-«хвост». Такой механизм модификации 3`-конца характерен для большинства и(м)РНК. Исключением является процессинг и(м)РНК белков гистонов. В пре-и(м)РНК гистонов в 3`-концевом участке отсутствует сайт ААУААА, поэтому полиаденилирования 3`-конца не происходит и процессинг ограничивается только расщеплением 3`-конца пре-и(м)РНК. Полиаденилирование также играет важную роль:

- обеспечивает стабильность и(м)РНК;

- способствует выходу мРНК из ядра в цитоплазму.

Необходимо отметить, что транскрипты РНК-полимеразы I и III не кэпируются и не полиаденилируются.

Сплайсинг

Этот процесс сводится к удалению интронов и соединению экзонов. Сплайсинг обычно начинается после полиаденилирования транскрипта и, вероятно, достаточно строго контролируется. Размер интронов ядерной пре-и(м)РНК составляет от 100 п.н. до 10 тысяч п.н. Не имеют интронов гены мяРНК, гены белков гистонов и гены митохондрий млекопитающих. Реакции сплайсинга осуществляются в специальных структурах - сплайсосомах. Сплайсосома - это крупный мультимолекулярный комплекс, который содержит порядка 145 молекул белков и молекулы малых ядерных РНК (мяРНК). В сплайсинге принимают участие белки, обладающие ферментативной активностью, необходима АТФ. Для того, чтобы исключить ошибки при вырезании интронов, границы интронов и экзонов представлены конценсусными нуклеотидными последовательностями. На 5`-конце интрона пре-и(м)РНК всегда находится пара нуклеотидов ГУ, а на 3`-конце - пара АГ. С этими последовательностями связываются мяРНК, что обеспечивает точность вырезания интронов и соединение экзонов в ходе созревания пре-и(м)РНК. Если нарушается этот процесс, то это может вести к развитию мутаций. Число удаляемых интронов у эукариот варьирует от 1 до 50. В среднем показано, что пре-и(м)РНК длинной около 50000 п.н. превращается в результате сплайсинга в матричную РНК длиной около 1500 п.н. Таким образом, большая часть РНК, синтезированной РНК-полимеразой II, в ядре распадается. Только 5% первичных транскриптов попадает в цитоплазму в форме зрелых и(м)РНК. У прокариот молекулы мРНК процессингу не подвергаются.

Процессинг рРНК и тРНК у прокариот и эукариот в основном заключается в разрезании и удалении лишних фрагментов с концов молекул. Гены рРНК у эукариот представлены тандемно повторяющимися блоками генов: 5`-18SрРНК-5,8SрРНК-28SрРНК-3`. В результате процессинга первичного транскрипта рРНК происходит нарезание трех зрелых молекул рРНК: 18SрРНК; 5,8SрРНК; 28SрРНК. Некоторые эукариоты (например, инфузории) содержат интрон в предшественнике 28SрРНК. В этом случае процессинг включает стадию сплайсинга - удаление интрона и соединение фрагментов рРНК, в результате образуется 26SрРНК. Процессинг тРНК эукариот в целом аналогичен процессингу тРНК у прокариот. Он сводится к вырезанию из первичных транскриптов тРНК и подрезанию. Важное отличие процессинга тРНК эукариот - наличие в молекуле пре-тРНК короткого интрона, который вырезается с участием специфической эндонуклеазы. Этот вариант сплайсинга происходит в ядре, но отличается от стандартного вырезания интронов, характерных для пре-и(м)РНК.

Альтернативный сплайсинг

Это форма сплайсинга, при которой соединение экзонов в процессе созревания мРНК происходит в разных комбинациях, но порядок расположения экзонов не нарушается. В результате альтернативного сплайсинга из одной молекулы пре-и(м)РНК образуются разные молекулы зрелых и(м)РНК, которые содержат разные наборы экзонов и кодируют синтез разных вариантов (изоформ) белков, что определяется специфичностью клетки (ткани). При этом число вариантов зрелых молекул и(м)РНК, образующихся из одного первичного транскрипта, может быть достаточно большим, приближаясь к величине 2ⁿ, где n-число экзонов данного гена.

Альтернативный сплайсинг - один из основных механизмов порождения белкового разнообразия у высших организмов. Как известно, при наличии в геноме человека около 24 тысяч генов, кодирующих белки, в клетках разных тканей синтезируется более 500 тысяч разных белков и основным механизмом формирования белкового разнообразия является альтернативный сплайсинг. Согласно современным данным более 70% первичных транскриптов генов человека подвергается альтернативному сплайсингу. Альтернативный сплайсинг может проходить разными способами, в частности:

- использование разных промоторов при синтезе и(м)РНК на одной матрице ДНК (альтернативный выбор промотра);

- альтернативный выбор участка полиаденилирования;

- альтернативный выбор экзонов.

Пример альтернативного сплайсинга при альтернативном выборе промотора (рис. 1):

Схема фрагмента гена, содержащего 2 промотора, 4 экзона и 3 интрона (внутренний промотор Р2 находится в одном из интронов):

→			→
Р1	Экзон1	Интрон1	Р2	Экзон2	Интрон2	Экзон3	Интрон3	Экзон4

Выбор промотора P1: фрагмент мРНК после сплайсинга, вместе с интронами 1 и 2 вырезается экзон 2:

экзон1

экзон3

экзон4

Выбор промотора P2: фрагмент мРНК после сплайсинга. Экзон 1 не входит в первичный транскрипт:

экзон2

экзон3

экзон4

Рис.1. Схема механизма сплайсинга при альтернативном выборе промотора: P1 - промотор 1; P2- промотор 2; направление транскрипции - →.

Выбор промотора зависит от наличия специфических факторов транскрипции, характерных для данного типа клеток.