Контрольные вопросы
1.В чем сущность метода гель-проникающей хроматографии?
2.Какова структура ячейки сефадекса и чем отличаются различные марки сефадекса?
3.Каков принцип разделения смеси белков с различной молекулярной массой на геле сефадекса?
4.Каковы методы количественной оценки белков во фракциях?
|
Литература |
1. |
Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. 253 с. |
2. |
Жидкостная колоночная хроматография: В 3 т. / Под ред. |
В.Г. Березина. М.: Мир, 1978. Т. 2. 471 с.
3.Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по биохимии. М.; Просвещение, 1975. С. 42-45, 75-76.
4.Карцова А.А. Жидкостная хроматография в медицине // Соросовский образовательный журнал. 2000. № 11. С. 35-40.
8.5.Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
8.5.1. Теоретические основы метода
Жидкостная хроматография в ее классическом варианте (при атмосферном давлении) и высокоэффективная жидкостная хроматография (при повышенном давлении) используются для определения химически и термически нестойких, нелетучих или очень полярных веществ, но в то же время могут быть применены для анализа веществ, которые обычно определяются с помощью высокоэффективной газовой хроматографии. Начав развиваться с середины 70-х годов, метод ВЭЖХ в первое время существенно проигрывал из-за отсутствия подходящих сорбентов для заполнения колонок. Однако с появлением привитых фаз насадочные колонки стали обеспечивать воспроизводимые результаты, что сделало ВЭЖХ идеальным инструментом для определения большинства пестицидов, включая хлор- и фосфорорганические производные, полиароматических углеводородов, относительно нелетучих высокомолекулярных загрязнителей. С помощью жидкостной хроматографии можно разделять
149
также белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, красители, полисахариды, взрывчатые вещества, лекарственные препараты, метаболиты растений и животных.
Блок-схема прибора для жидкостной хроматографии представлена на рис. 8.8.
o%ä",›…= |
|
m=“%“…= |
|
|
|
|
|
|
h…›е*2%! |
||
-=ƒ= |
|
“,“2еì= |
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
j%ë%…*=
|
|
|
|
|
|
q=ì%C,“еö |
|
dе2е*2%! |
|
||
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
h…2еã!=2%! q,“2еì=
%K!=K%2*,
ä=……/.
Рис. 8.8. Блок-схема жидкостного хроматографа
Для эффективного хроматографического разделения определяемых компонентов чаще всего применяют колонки длиной до 25 см и внутренним диаметром 4 – 5 мм, заполненные сферическими частицами силикагеля размером от 5 до 10 мкм с привитыми октадецильными группами. Появление в последние годы колонок меньшего диаметра, заполненных более мелкими частицами силикагеля, привело к уменьшению расхода растворителей и продолжительности анализа, увеличению эффективности разделения.
Следует отметить, что колонки для ВЭЖХ довольно дорогие. Поэтому их защищают от загрязнения предохранительным картриджем (предколонкой). Очень сложные смеси лучше предварительно разделять другими методами, а при переходе от одного растворителя к другому следует избегать резких скачков их полярности. Растворы проб и растворители перед вводом в колонку необходимо фильтровать.
Для обнаружения анализируемых веществ в ВЭЖХ широко применяются устройства, работа которых основана на измерении поглощения в ультрафиолетовой области, флуоресценции или электрохимических характеристик. Возможно также сочетание жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. Чаще всего применяется УФ-детектор. Он представляет собой высокочувствительный СФ-спектрометр с проточной
150