ление клеточного материала и уплотнение белков. В нижнем геле происходит разделение белков.

6.4. Диск-электрофорез

Электрофорез в ПААГе часто называют диск-электофорезом. Это название происходит от двух английских слов – discontinuity, обозначающего в данном случае неоднородность электрофоретической среды, и discoid – дискоообразный. Дело в том, что по случайному совпадению при стандартных условиях проведения опыта разделенные зоны имеют форму дисков.

Для диск-электрофореза характерны скачкообразные изменения pH, концентрации геля и градиента напряжения. Как известно, нижняя часть трубки заполнена разделяющим гелем с порами, которые действуют как молекулярное сито по отношению к разделяемым молекулам. Над разделяющим гелем имеется концентрирующий гель, имеющий крупные поры и поэтому не обладающий свойствами молекулярного сита, а еще выше располагается стартовый гель, содержащий пробу и краситель, использующийся в качестве свидетеля. Смысл диск-электрофореза состоит

всоздании очень узкой стартовой зоны, которая обеспечивает высокую разрешающую способность. Как это достигается?

Дело в том, что в состав как электродного буфера, так и буфера концентрирующего геля входит слабое аминное основание - трис, но в электродный буфер к трису прибавлена слабая кислота глицин (трисглициновый буфер, pH = 8,3), а концентрирующий гель содержит соляную кислоту, что дает буферную систему трис-HCl, pH = 6,7 (рис. 6.1.).

Глицин при pH = 8,3 находится в виде цвиттериона (биполярного иона) и только 5% приходится на долю глицинатного аниона. В электрическом поле глицинатные ионы, движущиеся из верхнего резервуара

вконцентрирующий гель, имеют гораздо меньшую подвижность, чем ионы хлора, и, следовательно, ”тянутся” позади них. В среде верхнего геля при pH=6,7 подвижность глицинатных ионов становится еще меньше, так как в результате дополнительного протонирования увеличивается количество цвиттерионов (изоэлектрическая точка глицина). Ионы хлора, наоборот, продвигаются очень быстро, и между этими двумя разновидностями ионов возникает граница раздела. Так как и ионы хлора, и глицинатные ионы представляют собой часть одной и той же электрической системы, то в области локализации менее подвижных глицинатных ионов напряжение увеличивается, а в области более подвижных ионов хлора – уменьшается. Следовательно, замыкающие ионы будут стремиться догнать ведущие, а белковые анионы, промежуточные по подвижности, будут располагаться между первыми и вторыми иона-

102

ми. В итоге происходит концентрирование белковых анионов позади ведущих ионов. Образуется чрезвычайно узкая белковая полоса, которая подходит к разделяющему гелю вслед за ионами хлора.

глициновый

буфер

исходный объем пробы концентрирующий гель мелкопористый гель глициновый буфер

Рис. 6.1. Разделение белков с помощью диск-электрофореза

крупнопористая противоконвекционная среда

Когда замыкающие глицинатные ионы доходят до нижнего геля, их число и подвижность увеличиваются, поскольку значение pH = 9,5 приближается к pK глицина. Теперь подвижность глицинатных ионов становится выше, чем у белковых анионов, подвижность которых замедляется в разделительном геле вследствие эффекта молекулярного сита. Глицинатные ионы перегоняют все белковые молекулы и догоняют анионы хлора. Как только последний ион хлора уходит из нижнего геля, pH повышается, потому что ионы хлора заменяются более основными глицинатными, и вместо исходной буферной системы трис-HCI образуется трис-глициновый буфер. Вследствие этого возрастает отрицательный заряд белковых анионов, и их движение происходит в соответствии с величинами отношения заряд/масса.

103