1. Вирусологический (культуральный) метод

Культура клеток: культуры клеток почки африканской зеленой мартышки линии Vero и мышиных фибробластов (LLC-MK2).

Вирусы SARS-CoV и MERS-CoV обладают выраженным цитопатическим действием на клетки-мишени. Характерной чертой этого действия становится образование везикул, окруженных двойной мембраной. Такие везикулы являются аутофагосомами, которые не сливаются с лизосомами. Инфицирование многими коронавирусами может индуцировать образование синцития, обусловленного физиологической активностью вирусного шипикового белка при нейтральном рН.

SARS-CoV индуцирует некроптоз.

NB! Некроптоз - запрограммированная форма некроза, так как видны морфологические признаки, сходные с некрозом (набухание клеток с последующим разрывом плазматической мембраны), но при этом некроптоз имеет четкую систему регуляции.

Выраженным цитопатическим эффектом обладает белок Е вируса SARS-CoV, который формирует ионный канал в мембране комплекса Гольджи, что приводит к ионному дисбалансу в клетке и активации NLRP3-инфламмасомы.

2. Молекулярно-генетические методы

а) Полимеразная цепная реакция

б) Петлевая изотермическая амплификация РНК

В отличие от метода полиразмерной цепной реакции, амплификация РНК происходит при постоянной температуре реакционной смеси, а также с использованием более производительных ферментов. За счет этого время исследования сократилось с 90 минут при классической ПЦР-диагностике до 15-20 минут.

Метод основан на образовании шпилечных структур ДНК в ходе начала реакции, которые служат началом для последующих этапов амплификации. При этом происходит выпетливание определенных участков ДНК, к которым по правилу комплементарности подобраны олигонуклеотиды – две пары обязательных (F3 и B3, FIP и BIP) и пара дополнительных, увеличивающих скорость реакции («петлевые» олигонуклеотиды LF и LB). Реакцию можно разделить на три этапа: (i) начало амплификации, при котором происходит посадка олигонуклеотидов FIP и BIP и наработка гантелевидных ДНК-структур с двумя петлями; (ii) циклическая амплификация — наработка ДНК-продуктов с гантелевидной структурой; (iii) элонгация — наработка ДНК-продуктов различной длины и с множеством петель. За наработку ампликонов отвечает термостабильная Bst-полимераза, которая увеличивает количество участков ДНК до обнаруживаемого количества копий. Bst-полимераза обладает 5´ → 3´ полимеразной активностью, однако лишена 5´ → 3´ экзонуклеазной активностью. Кроме того, Bst-полимераза обладает способностью замещать ранее синтезированную нить ДНК, что позволяет использовать её в методе LAMP. Реакция проходит при температуре от 60 до 65 °C в течение 15–60 минут.

в) ПЦР «в реальном времени» («real-time PCR»)

При использовании такого метода можно прямо в ходе реакции наблюдать за накоплением продуктов ПЦР (по флуоресценции). Соответственно, для проведения ПЦР «в реальном времени» нужен специальный прибор, способный возбуждать и считывать флуоресценцию в каждой пробирке. Поскольку число копий в ходе ПЦР растет экспоненциально, так же растет и флуоресценция. Однако это продолжается недолго, поскольку в какой-то момент эффективность реакции начинает падать из-за постепенной инактивации полимеразы, нехватки каких-то компонентов и т.п.

В состав реакционной смеси, наряду с праймерами  и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается от него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула (флуорофор), а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует. В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки. Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК. В процессе восстановления и синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимеразы расщепляет этот зонд и разрушает его. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора.

3. Методы детекции антигена - иммунохроматографические тесты

Тест на антиген является быстрой альтернативой ПЦР, не требующий лабораторного оборудования и специальных условий проведения. 

Тест-система создана на основе анализа отделяемого из носоглотки в иммунохроматографическом анализе.

После внесения образца на подушку антигены образца взаимодействуют с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом, нанесенными на подушку конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с иммобилизованными на Тестовой линии антителами. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоска. Не связавшиеся на тестируемой полосе антитела мигрируют далее вдоль нитроцеллюлозной мембраны и неизбежно взаимодействуют с иммобилизованными на Контрольной линии антигенами. В результате появляется вторая окрашенная полоска. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена в образце биологической жидкости.