Александров Ю.И., Анохин К.В. - Нейрон. Обработка сигналов. Пластичность. Моделирование_ Фундаментальное руководство (2008)
.pdfУ цианобактерий Synechococcus elongatus PCC 7942 продукт трех генов (kaiA, kaiB, and kaiC) был идентифицирован как основной компонент циркадных часов. Осцилляции фосфорилирования KaiC являются первичным пейсмекером цианобактериальных циркадных часов и открывают новые функции протеинов как устройств для измерения времени, которые управляют клеточным метаболизмом. В дальнейшем анализировали четыре аспекта цикла фосфорилирования KaiC in vitro: взаимодействие KaiA, KaiB и KaiC; функции двух сайтов фосфорилирования, энергетика, которая определяет циркадный период, механизм, синхронизирующий компоненты осциллятора Kai. Результаты этого анализа дали возможность предположить участие трех протеинов в поддерживании биологического времени в живых клетках (Kondo, 2007).
Цианобактериальный циркадный осциллятор может быть реконструирован in vitro посредством смеси чистых протеинов KaiA, KaiB и KaiC, with ATP. Ритм фосфорилирования КаiC сохраняется по крайней мере в течение 10 дней без изменений. Смешивая осцилляторные образцы, имеющие разные фазы, и анализируя динамику их фазовых соотношений, мы обнаружили, что отчетливость ритма фосфорилирования KaiC восходит к быстрой синхронизации состояния фосфорилирования и направления реакции (фосфорилирование или дефосфорилирование) протеина KaiC. В дальнейшем было показано, что синхронизация тесно связана с дефосфорилированием KaiC протеина и опосредована изменением мономера между KaiC hexamers на ранних стадиях фазы дефосфорилирования. Этот автономный механизм синхронизации, вероятно, является основой для resilience цианобактериальной циркадной системы против количественных флуктуаций часовых компонентов во время таких событий, как клеточный рост и деление
(Ito et al., 2007).
Температурная независимость часов. Эндогенная суточная активность наблюдалась у живых организмов всех типов от микрооргназмов до млекопитающих, и была доказана эндогенная природа этих ритмов. Интерес к этим ритмам стимулировался исследованиями Фриша, Крамера, Парди и Папи. Они показали, что небесная навигация пчел, птиц и пресмыкающихся, скорее всего, осуществляется по биологическим хронометрам эндогенного типа. Подозрения, что в качестве органа времени используется эндогенная ритмика, подкрепляются наблюдениями температурной независимости пери-
370
одов этих ритмов. Поясним: если ритм является генератором времени по своей сути, то его скорость должна быть независимой от температуры внутри экологического предела. Температурная независимость системы часов у пойкилотермных животных была показана еще в 1932 году Уоллом на пчелах. Браун и Вебб показали температурную независимость ритмов у крабов и моллюсков, а Питтендрич нашел независимость ритма eclosion у дрозофилы. Рао нашел то же самое для приливно-отливного ритма у мидии. Последние работы на растениях показали их аналогичную нечувствительность периодов к температурному режиму. В 1948 году Пол показал, что одноклеточная подвижная зеленая водоросль имеет эндогенный ритм, но не исследовал температурную характеристику этого ритма. В этом исследовании сообщается о температурной независимости ритма эвглении.
Новые данные открывают возможность для предположений о том, что молекулярный механизм циркадных часов у Synechococcus elongatus составлен из множества осцилляторных систем, как это было описано для моделей часовых механизмов эукариотов. Но альтернативная интерпретация состоит в том, что пейсмекерный механизм, как это предполагалось прежде, лежит, прежде всего, в скорости гидролиза АТФ посредством часового протеина KaiC (Brunner M, Simons MJ, Merrow M., 2008). Хотя цианобактериальные часы имеют все те же самые фундаментальные свойства, что и эукариотические часы, их компоненты не гомологичны тем, которые обеспечивают измерение времени у животных, растений и грибов. Более того, вероятно, их механизм сильно отличается от описанного у модели эукариотических часов. Картина того, как обеспечиваются механизмы измерения времени у прокариотов, включает следующее: мультипротеиновая, мультимерная молекулярная машина создает протеины, домены которых демонстрируют скручивание common themes. Передача сигнала в и вне сердцевины часов, по-видимому, происходит через гистидинпротеинкиназную основу фосфорилирования вет-
âåé (Golden, 2003).
Циркадианные ритмы моллюсков. Одна из первых работ, в которой был зарегистрирован циркадианный ритм на уровне работы отдельного нейрона, — это исследования Штрумвассера (1975) на моллюске аплизии. При регистрации в изолированном париетовисцеральном ганглии аплизии было обнаружено, что нейрон R15 имеет цирка-
371
дианный ритм спайковой активности. Ритм обнаруживается in vivo при цикличности света и темноты. Фаза ритма у R15 является функцией не только от действия светового расписания, но также зависит от времени отсечения ганглия. Изменение времени отсечения ганглия во время света в цикле свет-темнота приводит лишь к незначительным изменениям в последующих пиках достижения максимума или минимума активности у R15. Отсечение ганглия во время темного периода приводит к смещению пика, который изменяется в зависимости от времени отделения ганглия. Циркадианный ритм R15 может быть фазово-сдви- нутым при помощи фазы включения цикла свет-темнота от одной до двух недель. Нейрон R15 у ослепленной аплизии, однако, не демонстрирует никаких фазовых сдвигов во времени. Делается вывод о том, что глаза важны для рецепции фотовоздействиий, направленных на ритм нейрона R15 in vivo, но нейронные связи от от глаз к R15 не
требуются (Audesirk and Strumwasser, 1975).
Генетика и циркадианные ритмы. Предположение о генети- ческой основе свободно текущих циркадианных ритмов возникло еще в 1932 году (Bünning, 1932). Множество примеров клеточных циркадианных систем подтверждает, что часы — это не просто эмерджентное качество сложной (мультиорганной) системы: оно основано на особых свойствах индивидуальных клеток. Работы на мутантах Drosophila melanogaster позволили открыть часовой ген (Konopka and Benzer, 1971). С тех пор были идентифицированы многие часовые гены, например, на мышах, Xenopus, Arabidopsis è Synechococcus (Merrow et al., 2005,
McClung, 2006).
13.5. Пейсмекеры супрахиазменного ядра
Супрахиазменное ядро (СХЯ) гипоталамуса является центром циркадианной системы в мозге позвоночных. Через нейронные и гуморальные выходы СХЯ может организовывать ряд физиологических и поведенческих ритмов всего тела. Удивительно, что циркадные ритмы порождаются не многоклеточными сетевыми свойствами, а фактически генерируются клеткой автономного уровня. Эндогенные часы основательно зашифрованы на молекулярном уровне посредством сцепления авторегуляторной транскрипционной и трансляционной петли обратной связи внутри каждой клетки. Такие же координированные циркадианные ритмы были идентифицированы в ряде типов клеток, тканей и органов всего тела. Эти наблюдения также применимы к
372
широкому ряду областей ЦНС, включая обонятельные луковицы, гипофиз, эпифиз, аркадные ядра, сетчатку. Важно, что было показано: эти ритмы не внешне управляются выходами СХЯ, а время или фаза, в которую ген продуцирует пик, часто является специфичным для области мозга.
Помимо генерирования четких ритмов, циркадианная система может быть чувствительна к внешним влияниям и способна регулировать свои фазы, чтобы синхронизироваться с превалирующим ритмом день/ ночь. У млекопитающих сигнализирование предъявленного света, выполняемое афферентами сетчатки, является самым важным запускающим сигналом часов СХЯ. Однако другие сигналы, такие, как наличие пищи, новая окружающая среда или социальные взаимодействия, могут действовать как знаки. Эти знаки достигают СХЯ по различным нейротрансмиттерным, нейромодуляторным или гормональным путям и могут перезапускать фазу экспрессии через авторегуляторную петлю обратной связи. Часы не-СХЯ могут быть непосредственно чувствительны к внешним воздействиям. Наиболее очевидным примером является сетчатка. Окончательный уровень сложности и тонкой настройки молекулярного ритма может определяться через локальные переговоры между часами ткани и ядер.
Для того чтобы молекулярные ритмы имели влияние на физиологию и поведение, они должны обращаться к соответствующим выходам. Это достигается сложной пространственно-временной регуляцией экспрессии гена, который влияет на клеточно-тканевые специфические функции. Настроенная экспрессия ряда так называемых часовых генов затем определяет временную регуляцию ритмов мозга и периферических тканей. Это может приобретать форму изменения выделения гормона, изменения скорости генерации потенциалов действия, изменять скорость клеточного метаболизма (рис. 13.22).
Все перечисленное выше указывает на то, что генерация суточ- ных ритмов в поведенческих и физиологических функциях вместе со способностью интегрировать ряд environmental входов подразумевает сложное устройство циркадианной системы. И очевидно, что эта система подразумевает действие многих генов. Более того, новые генетические факторы, которые влияют на циркадианные параметры, продолжают определяться посредством мутагенетического скриннинга, изучения взаимодействия протеинов и др. (Barnard, Nolan, 2008).
373
Ðèñ. 13.22. Циркадная система у животных организована иерархически. Молекулярные осцилляции генерируются на клеточном уровне, на котором часовые компоненты включают петлю обратной связи транскрипции-трансля- ции и, возможно, метаболическую регуляцию проводящих путей (слева). Органные или периферические часы развивают координированный ритм, который синхронизируется относительно пейсмекера мозга. Наиболее очевидным проявлением такой системы времени является цикл сон-бодрствование, но сотни параметров — от когнитивных функций до уровня циркуляции гормонов — также изменяются в течение 24 часов. Связь между мозгом и осцилляциями периферии была доказана, и эту связь можно прервать. (по The circadian cycle: daily rhythms from behaviour to genes First in the Cycles Review Series Martha Merrow1+, 2, Kamiel Spoelstra1& Till Roenneberg2 EMBO reports VOL 6. NO 10. 2005. P.p. 930-934).
У большинства млекопитающих ряд часовых генов и протеинов формируют регуляторную систему, которая продуцирует осцилляции циркадианного периода — 24 часа. Молекулярные и физиологические ритмы координируются с суточными изменениями окружающей среды посредством доминирующего циркадианного пейсмекера, СХЯ гипоталамуса. Нейроны СХЯ эндогенно генерируют циркадианный ритм и приспосабливают его к смене циклов день-ночь окружающей среды. Примерно 20000 нейронов СХЯ варьируют по способности чувствовать «ключи» времени по определенным признакам, по нейротрансмиттерам, к которым они имеют чувствительность, по свойствам их связей. Желание понять, как такая гетерогенная сеть продуцирует когерентный синхронный циркадный выход, является мотивом для проведения экспериментальных и теоретических работ.
Хотя все циркадианные системы составлены из клеточных часов, существуют большие различия в их составе. Например, у растений циркадианные ритмы соседних клеток, по-видимому, идут в независимых
374
фазах, а у животных они формируются на основе внутренне связанных иерархических систем (рис. 13.23). Открытый пейсмекер принадлежит нервной системе, которая получает информацию из окружающей среды о состоянии и о времени (например, сумерки или рассвет), обрабатывает их и передает эти сведения через эндогенную сигнализацию на периферию, поддерживая скоординированное время (наприер, печени, сердцу, почкам). Пейсмекер млекопитающих расположен в супрахиазменном ядре гипоталамуса. Так клеточные часы всего тела синхронизируются относительно «главных часов» и друг друга, хотя не обязательно, чтобы они имели одну и ту же фазу. Молекулярные осцилляции СХЯ мыши, постоянно находящейся темноте, например, сдвинуты вперед относительно печени примерно на 4–6 часов (Balsalobre et al, 2000). Более того, молекулярные часы печени при помощи особого расписания питания могут быть «отвязаны» от ритма, определяемого СХЯ.
Ðèñ. 13.23. Спонтанные и антидромные потенциалы действия нейронов супрахиазменного ядра. А — спонтанные потенциалы действия. Заметно, что деполяризационный препотенциал предшествует каждому ПД и что один препотенциал не достигает порога (отмечен стрелкой). Вa, Bb — частота и паттерн разрядов ПД изменяются в зависимости от удерживаемого на мембране тока в двух различных клетках. Ba и Bb имеют потенциал покоя -52 и -59 mV и максимум Ih от 0 до 45 pA соответственно (по Zhi-Gen Jiang, YuQin Yang, Zhao-Ping Liut and Charles N. Allen Membrane properties and synaptic inputs of suprachiasmatic nucleus neurons in rat brain slices Journal of Physiology 1997, 499.1, pp. 141-159).
375
Изолированные нейроны СХЯ. Супрахиазменное ядро гипоталамуса содержит первичные циркадианные часы млекопитающих. Диссоциированное на клетки СХЯ в переживающей культуре проявляют циркадианную модуляцию спонтанной электрической активности. Чтобы выявить присутствие различий в циркадианной фоновой активности нейронов, изолированных из СХЯ без синаптических связей, одна клетка исследовалась в течение 3-4 дней после изготовления препарата, до формирования дендритов, аксонов и синапсов. Различия фоновой активности в цикле день-ночь были обнаружены у изолированных нейронов СХЯ. В течение первого субъективного дня средняя частота разрядов (0,87+- 0,12 Гц) была значительно выше, чем в течение первой субъективной ночи (0,24+-0,12 Гц). А скорость разрядов на следующий день была значительно выше, чем в течение предыдущей ночи. Эти данные заставляют предполагать, что популяция изолированных нейронов из СХЯ с отсутствующими синаптическими контактами содержит функционирующие циркадианные часы (Kononenko et al, 2008).
Âработе Klisch et al. (2006) исследовалось поведение диспергированных клеток СХЯ 1–2-дневных крыс, культивирумых в мульти-микро- электродном массиве. Нейроны СХЯ идентифицировали по иммунной метке нейропептида аргинин-вазопрессин и вазоактивного интестинального полипептида. Одиночный нейрон СХЯ может экспрессировать паттерн скорости разрядов в разных циркадианных фазах. В этой культуре редко наблюдался синхронизированный паттерн разрядов. Это заставляет предполагать, что в культуре низкой клеточной плотности нейроны СХЯ функционируют как независимые пейсмекеры. Чтобы изучить, всегда ли на независимые пейсмекеры можно повлиять посредством фазо- во-сдвинутых стимулов, применили мелатонин (10pM к 100 nM) в тече- ние 30 мин. на разных циркадианных фазах и проводили постоянное наблюдение за ритмами частоты разрядов. Мелатонин мог вызывать ответы фазово-сдвинутые в отдельных часовых клетках, у которых не было входов от других нейронов. У некоторых клеток обнаруживался фазовый сдвиг ответов во втором или третьем цикле после применения мелатоина, но не в первом цикле. Фазовый сдвиг изолированных нейронов СХЯ также наблюдался, когда СХЯ не проявляло чувствительности к этим фазово-сдвинутым стимулам при регистрации от мозговых срезов.
Эти данные показывают,что нейронные сети играют существенную роль в контролировании фазовых сдвигов (Klisch et al., 2006).
Âкультуре ткани регистрировали активность нейронов из СХЯ в течение дней и даже недель. Были выявлены четкие циркадианные
376
ритмы в скорости разрядов этих нейронов (Welsh et al., 1995). Несмотря на обилие синапсов, циркадианные ритмы, экспрессируемые нейронами в той же самой культуре, не были синхронизированы. После обратимой блокады нейронных разрядов в течение 2,5 дней циркадианные ритмы нейронных разрядов возобновлялись без изменения фазы. Эти результаты заставляют предполагать, что СХЯ содержит большое количество автономных циркадианных осцилляторов, находящихся в отдельных клетках, а синапсы, которые формируются in vitro, не являются ни необходимыми для деятельности этих осцилляторов, ни доста-
точными для их синхронизации.
Роль ионов в работе пейсмекеров СХЯ. Отдельные нейроны супрахиазменного ядра способны функционировать как автономные часы и генерировать циркадианные ритмы, экспрессируя гены, которые формируют молекулярные часы. Существует мало данных о том, как координируются эти молекулярные осцилляции в отдельных часовых клетках, чтобы обеспечить согласованную ритмичность, которая обычно наблюдается в целостном СХЯ. Предполагается что кальциевый ток, проходящий через вольт-зависимые кальциевые каналы, играет важную роль в регуляции экспрессии генов и синхронизации ритмичности в популяции клеток СХЯ. В опытах Nahm et al. (2005) на культуре клеток СХЯ мозга крысы исследовалось влияние кальция на экспрессию и циркадианную регуляцию различных субъединиц вольт-зависимых кальциевых каналов. Клетки СХЯ крысы и клетки культуры показывали экспрессию mRNA для всех основных типов субъединиц альфа-кальциевых каналов. Для других типов субъединиц были показаны наивысшие уровни для L-субъединиц, наименьшие для R и N-каналов. Кальциевые каналы вовлекаются в регуляцию молекулярной ритмичности, и это исследовалось на клетках культуры при помощи неизбирательного антагониста кадмия. В клетках, обработанных кадмием, исчезал осцилляторный паттерн гена rPer2 и rBmall. При этом не затрагивалась клеточная морфология и viability. Эти данные поднимают вопрос том, что циркадианная регуляции активности кальций-зависимых каналов может играть важную роль в сохранении ритмичности часовых генов в ансамбле СХЯ осцилляторов (Nahm et al., 2005).
Нейроны СХЯ проявляют циркадианные ритмы в частоте генерации потенциалов спонтанной активности и в транскрипции основных часовых генов, включая Period1 (Per1). Ранее было показано, что К+ ток критичен для экспрессии нейрофизиологической ритмичности. В работе Pitts et al. (2006) исследовалось влияние общей проводимости
377
активируемых Са2+ К+ каналов (BK) на ежедневную ритмичность нейронов СХЯ. Рассматривалось влияние ВК-тока на Per1 у помеченных GFP нейронов при использовании фиксации напряжения и при блокаде работы ВК-каналов специфическим блокатором iberiotoxin. ВК-ток составляет большую часть выходящего тока клетки во время ночи, но не днем. Амлитуда и плотность ВК-тока выше во время ночи, а разница в стабильном состоянии амплитуд день/ночь не связана с избирательной инактивацией. Показано специальными методами присутствие копии ВК-каналов KCNMA1 в Per1-экспрессируе- мом нейроне. В дальнейшем опыты показали, что KCNMA1 mRNA ритмически экспрессируется в СХЯ под влиянием света. Острое торможение ВК-тока сглаживает циркадианные ритмы по частоте нейронных разрядов СХЯ. Эти результаты показывают, что функция ВКканалов возбуждается ночью, тем самым изменяя нейронную актив-
ность СХЯ (Pitts et al., 2006).
Пейсмекеры СХЯ в культуре ткани. Органотипические срезы СХЯ и нейроны СХЯ в культуре высокой плотности экспрессируют координированную ритмическую активность в течение всего периода их жизнеспособности ( от нескольких недель до нескольких месяцев), (Aton et al., 2005). Нейроны СХЯ в низкодисперсной культуре не проявляют координированной активности, а экспрессируют широкую вариацию их свободнотекущих периодов (Welsh et al., 1995, Honma et al., 2004). Это приводит к выводу о том, что нейроны СХЯ сохраняют собственные циркадианные осцилляторы, которые нуждаются в синхронизирующем сигнале, чтобы продуцировать когерентный выход (рис. 13.23). Среди кандидатов в синхронизирующие факторы нейропептид вазоактивного интестинального полипептида (VIP), gastrinreleasing peptide (GRP), prokineticin и нейротрансмиттер GABA (Liu et al., 2000). В работе этих авторов показано, что индивидуальные часовые клетки СХЯ могут синхронизроваться при помощи тормозного трансмиттера ГАМК. В опытах на культуре клеток было показано, что суточные изменения чувствительности СХЯ к фазово-сдвигающим агентам проявляются на уровне отдельных нейронов. Более того, GABA, действующая через рецепторы À-òèïà, может и сдвигать фазы, и синхронизировать часовые клетки. Это означает, что GABA является существенным синхронизатором нейронов СХЯ in vivo. На роль синхронизаторов также претендует G-белок. Предположение о взаимозависимости, согласно которому нейротрансмиттер высвобождается циркадианным способом и действует через обратную связь на часы, было продвинуто мно-
378
гими авторами (Maywood et al., 2006, Aton et al., 2005). В работах анализировали последствия направленного прерывания транскрипции генов, кодирующих VIP или же его рецептор VPAC2. В обоих случая не только терялась синхронность в работе клеток СХЯ, но и большая часть нейронов СХЯ начинала работать асинхронно. Аналогично, торможение натриевых каналов при помощи тетродотоксина (ТТХ) десинхронизировало и подавляло осцилляторную активность часовых нейронов (Yamaguchi et al, 2003). Опыты показывают, что активность нейронной мембраны играет чрезвычайно важную роль в проявлении внутриклеточных ритмов и координации нейронных часов (Lundkvist, Block, 2005). Lundkvist and Block (2005) считают, что события, происходящие на нейронной мембране, играют важнейшую роль в проявлении циркадианных ритмов у моллюсков и млекопитающих. У млекопитающих супрахиазменное ядро гипоталамуса получает световую информацию через ретиногипоталамический тракт. Сетчаточные сигналы, опосредованные глутаматом, вызывают высвобождение кальция и активируют ряд внутриклеточных каскадов, вовлеченных в фотоуправление и фазовый сдвиг. Мембранные процессы также вовлекаются в экспрессию ритма. Кальциевый и натриевый токи влияют на электрический выход пейсмекерных нейронов, изменяя форму и интервалы между импульсными препотенциалами, периодами следовой гиперполяризации и межспайковые интервалы, также влияя на мембранные потенциалы и таким образом формируя паттерн спайковой ритмичности. Несмотря на вовлечение мембранных событий в циркадианные проявления и экспрессию, менее ясно всегда, ли электри- ческая активность, постсинаптические явления, трансмембранные ионнные токи также являются существенными элементами в генерации ритмов. Однако данные позволяют предполагать, что на самом деле решающую роль в генерации циркадианных ритмов играет ак-
тивность нейронных мембран.
Молекулы и транскрипция. Опыты показывают, что только СХЯ способно к эндогенной самосохраняющейся ритмичности и функционированию в качестве задавателя ритма, навязывая ритмические свойства другим клеткам, хотя периферические ткани и иммунные процессы могут периодически экспрессировать ритмические осцилляции в часовых генах. Чтобы по-разному исследовать молекулярные элементы, необходимые для различных ритмо-генерирующих и пейсмекерных свойств СХЯ, действие antisense — торможения на экспрессию часовой ритмичности по выходу 2-deoxyglucose и экспрессии гена Per срав-
379