Методичні рекомендації
Замалювати в зошит основні методи ураження ембріону.
Якими методами можна індифікувати вірус у вірусовмісному матеріалі, що був отриманий на курячому ембріоні?
Дати характеристику вірусів що викликають захворювання птахів.
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка_________________________
Лабораторна робота № 5 Тема: Принципи культивування вірусів в культурі клітин.
Мета: ознайомитися з загальними відомостями про культурах клітин, сольовими розчинами і живильними середовищами, рецептурою їх приготування, відпрацювати техніку підготовки необхідного посуду при отриманні культури клітин.
Обладнання та матеріали: середовище 199, 5% -ний гемогідролізат, 0,5% -ний гідролізат лактальбумина, 0,25% -ний розчин трипсину, розчин Хенкса, 7,5% -ний розчин соди на дистильованій воді, розчин версена, бичача сироватка та інші сре¬ди, змонтована для стерилізації посуд, піпетки, гумові пробки, таблиці по темі.
Хід роботи
Теоретичні відомості
Культура клітин - це клітини тканин різних органів багатоклітинного організму, що живуть і розмножуються в штучних умовах поза організмом (in vitro). При цьому в пробірках або матрацах утворюється клітинний моношар. Культуру клітин практично можна отримати з будь-якого органу або тканини людини або тварини (дорослого або ембріона). Проте, краще це вдається зробити з ембріональних органів, так як їх клітини ще слабо діференційовані і мають більш високу потенцією росту.
Головними нововведеннями, спростити культивування клітин і сприяли поширенню методу клітинних культур, були: 1) використання антибіотиків "не ушкоджують тварини клітини, але запобігають забрудненню культур бактеріям; 2) отримання з карциноми людини лінії клітин (HeLa), здатних невизначено довго рости in vitro і воспри-імчівих до великого числа різних вірусів людини (Gey et al "1952; Scherer et al., 1955); 3) розробка Іглом (Eagle, 1960) простий живильного середовища, що підтримує розмноження клітин багатьох типів; 4) удосконалення методів отримання клонів з одиничних клітин ссавців (Puck et al., 1957).
Наявність клітинних культур і методу кількісного визначення вірусів шляхом підрахунку утворених ними бляшок в рівній мірі стимулювало розвиток двох аспектів вірусології. По-перше, в результаті клінічних та епідеміологічних досліджень були відкриті сотні нових вірусів - так багато, що деякі з них до цих пір не вдалося пов'язати з будь-якими відомими хворобами (Jackson, Muldoon, 1975). По-друге, виникла можливість виробництва вакцин в промислових маштабах. До початку 1960-х років тільки проти поліомієліту було вакциновано кілька сотень мільйонів чоловік, і тепер у всіх країнах захворюваність на поліомієліт різко знизилася. У клітинних культурах були отримані й інші вірусні вакцини, наприклад протикорова, і після успіху профілактики поліоміеліта вони отримали широке застосування. Методи отримання вірусів у великих кількостях виявилися корисними і для загальної вірусології, вони полегшили очистку вірусів.
У вірусологічній практиці найбільш широко застосовують одношарові культури клітин. Останні, залежно від висхідного матеріалу, підрозділяють на первинні (отримують безпосередньо з органів тварин і людини) і перевиваються (адаптують первинні культури до умов життя у пробірці). Їх отримують шляхом обробки шматочків тканин ферментами (трипсин). Останні розпадаються на клітини, які і вирощують у вигляді одного шару (моношару) на внутрішній поверхні скла.
У вірусологічній практиці застосовують такі культури клітин.
1. Первинні. Їх готують безпосередньо перед застосуванням (для тривалого культивування вони не придатні). Їх можна отримати з різних органів і тканин людини і тварин. Проте, краще це вдається зробити з ембріональних органів. Найчастіше використовують нирки, легені, шкіру, тимус, ембріонів або молодих тварин. Після відповідної підготовки їх подрібнюють на шматочки розміром 1 ... 2 мм і обробляють трипсином . Потім отриману суспензію клітин розливають по пробірках або в інший посуд, заливають живильним середовищем, інкубують в термостаті і отримують моношар клітин. Зазвичай він формується через 3 ... 5 днів. Швидкість формування залежить від виду тканини, віку тварини, якості поживного середовища, посівний концентрації клітин та інших факторів. Поживне середовище міняють у міру її забруднення продуктами життєдіяльності клітин. Моношар зберігає життєздатність протягом 7 ... 21 дня.
З первинних клітин можна отримати субкультури шляхом зняття їх зі скла розчином версена (або сумішшю версії і трінсіна) і ресуспендування в новій живильному середовищі. Субкультури отримують від 2-5 пасажів і дуже рідко до 8-10. По-такі пасажі призводять до зміни морфології клітин та їх загибелі.
2. пересіваємих. Це клітини, здатні до розмноження поза організмом невизначено тривалий час. У лабораторіях їх підтримують шляхом пересівань з однієї судини в іншій за умови заміни живильного середовища. Отримують перевиваються клітини з первинних культур клітин з підвищеною активністю росту шляхом тривалих пересівань в певному режимі культивування. Ця робота проводиться протягом багатьох місяців. Вважають, що механізм походження перевіваемих клітин - результат їх генетичної мінливості.
Клітини перевіваемих культур мають однакову форму, гетероплоідний набір хромосом (у первинних культур він диплоїдний), стабільні в умовах зростання в пробірці, деякі з них мають онкогенної активністю. Остання властивість огранічує їх використання при виробництві вакцин.
Перевиваються клітини можна отримати як із здорових тканин тварин, так і з пухлинних. Приклади таких клітин: ВНК-21 (нирка новонародженого хом'ячка); ППТ (перевивається нирка теляти); ППО (перевивається нирка вівці); НеLа - (ракові пухлини шийки матки жінки); Нер-2 (карцинома гортані людини); Нер -3 (лимфоидная карцинома людини) та ін.
3. Диплоїдні. По суті справи це перевиваються культури з подвійним (правильним) набором хромосом. У перших 50-60 пасажах такі культури залишаються диплоїдними і їх широко використовують для вирішення ряду теоретичних і практичних завдань біології (приготування біопрепаратів для людини, виділення онковирусов та ін.). Вони дуже життєздатні, не схильні морфологічних змін, вільні від спонтанного вирусоносительства і т.д.
Підготовка посуду. Якість посуду має важливе значення для успішного культивування клітин поза організмом. Кращою є посуд з силікатного або натрієвого скла. Посуд має бути чистою, знежиреної, чи не володіти токсичною дією, абсолютно стерильною.
Запропоновано багато способів обробки посуду і в кожній лабораторії вибирають найбільш підходящий з них. При культивуванні клітин особливо великі вимоги висувають підготовки та стерилізації посуду, пробок та інших матеріалі У багатьох випадках неправильна їх мийка і стерилізація служать причиною ненатягнутих клітин до скла або швидкої генерації клітинного моношару.
При обробці посуду необхідно враховувати високу чутливість клітин до токсичної дії солей важких металів. Однією з обов'язкових умов успішної роботи клітинами є висока якість води. Для обполіскувати посуду використовують дистильовану, а краще дистильовану воду.
Зазвичай весь посуд, як нову, так і колишню у вживанні (БУ), поміщають в мильний розчин, а інфіковану - мильно-феноловий (1% мильної емульсії + 5% фенолу) на добу. Потім посуд миють теплою водою і обробляють за такою методикою. Занурюють на 3 год у розчин хромом (на 1л концентрованої сірчаної кислоти додають 80 г двухромів кислого калію КзСг207); розчин повинен бути жовтуватого коричневого кольору, якщо він набуває зелене забарвлення значить хромова кислота відновилася і розчин непридатний для використання. Після обробки в хромом посуд 5 ч промивають у проточній водопровідній воді, обполіскують в декількох змінах дистильованої води, сушать, монтують стерилізують 1,5 ... 2 год в сушильній шафі (170 ... 180 ° С). Посуд БО обробляють хромом протягом 1 год і стерилізують при аналогічних умовах.
Піпетки після роботи збирають в банки з дезинфікуючим розчином і витримують в них не менше доби, потім видаляють ватяні прокладки, промивають хромом, водопровідної дистильованою водою, поміщають на деякий час 96 ° -ний етиловий спирт, висушують, монтують і стерилізують у сушильній шафі 1, 5 ... 2 год при 170-180 ° С.
Нові гумові пробки містять токсичні для клітин речовини. Для видалення їх миють у теплій воді щітками, прополіскують водопровідною водою, кип'ятять в 2% -му розчині NаОН протягом 3 хв, знову прополіскують водопровідною водою, 5 хв кип'ятять в 1,8% -ному розчині НС1, обполіскують водопровідною водою, три рази дистильованою, сушать на повітрі, монтують і стерилізують в автоклаві 1 год при 0,15 МПа).
Пробки БО автоклавують і 1 ч кип'ятять, миють щітками, прополіскують водопровідною водою, один раз дистилюють , кип'ятять протягом години в дистильованої води, 3 рази прополіскують в дистильованої воді, висушують, монтують, стерилізують в автоклаві.
Інструменти кип'ятять в дистильованої води та занурюють в стакан зі спиртом (стакан повинен знаходитися в боксі). Перед кожною маніпуляцією їх пропалюють на спиртівці.
Сольові розчини. Для культивування клітин більшіть поживних середовищ готують на збалансованому сольовому рас¬творе, для якого необхідні високоочищені препарати, так як сліди ряду домішок (свинець, ртуть і інші важкі метали) токсичні для клітин. Сольові розчини готують на дистилльованій воді. Вони забезпечують збереження рН, осмотоксичного тиску в клітинах, відповідну концентрацію необхідних неорганічних речовин. Кращими з них являються розчини Хенкса і Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь живильного середовища.
Розчин Хенкса: На 1 л бидистиллированной води беруть
NаС1 - 8,0 г, КСl - 4,0 г, MgSO4 • 7Н2О - 2,0 г, СаС12 - 1,4 г, КН2Р04-0,6 г, глюкози - 10 г, 0,2% -го фенолрота- 4,0 мл, Nа2НР04 - 0,6 м
Розчин Ерла: на 1 л бидистиллированной води добавляють- NаС1 - 6,8 г, КС1- 0,4 г, СаС12-0,2г, MgSO4 -0,1 г, NaH2PO4-0,125 г, NaHCO3-2,2 г, глюкози - 1,0г.
Для визначення в сольових розчинах і поживних середовищах концентрації водневих іонів (рН) застосовують індикатор феноловий червоний (0,002%). Він не має токсичної дії на клітини і віруси. При зрушеннях рН в лужну сторону розчини приймають червоно-малинове забарвлення, в кисло- жовту. При нейтральному значенні рН (7,2 ... 7,4) колір середовища оранжево-червоний. Для регулювання рН сольових розчинів поживних середовищ використовують 7,5% -ний розчин бікарбоната натрію NaHCO3 і 3% -ний розчин оцтової кислоти СН3СООН. Ці розчини готують на дистильованій воді, стерилізують кип'ятінням і зберігають у холодильнику при 4 ... 6 ° С не більше місяця.
Щоб отримати одношарову культуру клітин, застосовують протеолітичні ферменти, що руйнують цитоплазматичні містки між клітинами. До таких належать трипсин, панкреатин, папаїн та ін. Найбільш часто використовують трипсин у вигляді 0,25% -ного розчину на фосфатному буфері. Зберігають його в замороженому стані 6 ... 8 місяців.
При пересіві клітин з метою відокремлення їх від скла використовують версії (натрієва сіль етилендіамінтетраоцтової кислоти). Він чинить на клітини більш легке дію, ніж трипсин. Механізм дії полягає в тому, що він вступає в реакцію зі склом, утворюючи проміжне з'єднання, яке механічним шляхом відділяє клітини один від одного.
Поживні середовища. Розрізняють штучні (полусентетичні і синтетичні) і природні поживні середовища.
Природні поживні середовища - це біологічні рідини (сироватка крові, ембріональний екстракт, асцитичної рідина, коров'яча амніотична рідина, тканинні екстракти та ін.).
Поживні середовища з природних компонентів застосовують рідко, головним чином для вирощування знову замкнені тканин на початку культивування і для підтримки дуже примхливих тканин тварин.
До полусинтетичних живильних середовищ відносять гемогідролізати, гідролізат лактальбумина, аминопептид та ін.
Кращою штучної живильним середовищем є синтетичне середовище 199. Вона містить 60 компонентів: 10 амінокіслот, 17 вітамінів, 8 мінеральних солей, 10 компонентів, я входять до складу нуклеїнових кислот та ін.
Крім того, середовища поділяються на ростові і підтримують. Ростові застосовуються в перший фазі культивування клітин. Вони багаті поживними речовинами і сприяють активному розмноженню клітин (наприклад, 5% -ий гемогідролізат + 10% бичачої сироватки). Підтримуючі середовища використовують в 2-ій фазі культивування клітин - після зараження культури клітин вірусами. Вони підтримують життєздатність клітин. З підтримують середовищ зазвичай виключають сироватку.
Для знищення мікрофлори перед використанням в середовище додають пеніцилін (100 ОД / мл), стрептоміцин (50 ОД / мл), тетрациклін (100 ОД / мл), встановлюють рН 7,2 ... 7,4; в ростові середовища, крім того, вносять 10% бичачої сироватки.