Хід роботи

1. Теоретичні відомості

Реакція непрямої гемаглютинації дозволяє вирішити такі діагностичні завдання:1) виявити антитіла і визначити їх титр у досліджуваних сироватках крові;

2) виявити та ідентифікувати невідомий вірусний антиген.

Сутність реакції в тому, що еритроцити, на яких попередньо адсорбовані антигени або антитіла, здатні агглютинироваться в присутності гомологічних антитіл або антигенів. Еритроцити виконують роль носіїв зі специфічними детермінантами, аглютинація яких відбувається в результаті реакції антиген-антитіло. Реєструють дану реакцію за характером утвореного осаду еритроцитів, т. о., вона є суто специфічною серологічної. Необхідно відзначити, що РНГА відрізняється від РДА. В РДА еритроцити агглютинируются з рецепторами вірусів за рахунок своїх комплементарних рецепторів. В РНГА аглютинація відбувається за рахунок утворення комплексів антиген + антитіло (рис.). Якщо до поверхні еритроцитів приєднати антигени, отримують антигенний еритроцитарний діагностикум, здатний в досліджуваній сироватці визначати антитіла. І, навпаки, еритроцити, сенсибілізовані антитілами, називають антительным еритроцитарних діагностику-

мом і застосовують для швидкого виявлення антигенів у різних субстратах.

Переваги РНГА. Ця реакція має високу чутливість, перевершуючи РІД, РСК і наближаючись до иммуноферментному аналізу, відрізняється простотою техніки постановки і швидкістю відповіді (2...3 год). Недолік - визна-лені труднощі в приготуванні стабільних еритроцитарних діагностикумів.

Компоненти реакції. Для визначення антитіл у досліджуваних сироватках необхідно мати: а) антигенний еритроцитарний діагностикум; б) досліджувану сироватку крові; в) розчинник (у ньому ставиться реакція). Для визначення антигенів в досліджуваних біологічних рідинах необхідно мати: а) антитільний эритроцитатный діагностикум; б) досліджуваний біологічний субстрат; в) розчинник.

Постановка РНГА включає наступні основні етапи:

а) приготування розчинів і підготовка досліджуваних рідин;

б) отримання еритроцитарних діагностикумів;

в) постановка головного досвіду РНГА.

Зазвичай в лабораторіях ставлять тільки головний досвід, а інші процедури проводять на підприємствах біологічної промисловості.

Підготовка розчинів та досліджуваних рідин. Фізіологічний розчин, забуференный фізіологічний розчин (рН 7,2), розчинник готують на дистильованій воді. Фізіологічний розчин готують за загальноприйнятою методикою. Для приготування забуференного фіз-розчину з рН 7,2 до 1 л останнього додають 0,49 р КНаР04 і 1,62 м Na2HP04, стерилізують кип'ятінням, охолоджують і використовують у роботі. Цей розчин застосовують для відмивання еритроцитів, акролеинизации і танизации їх. Розріджувач готують, додаючи до фізрозчину 0,3% фенолу і 1% нормальної кінської сироватки. Його використовують для розведення досліджуваних сироваток або інших рідин, а також для зберігання еритроцитарного діагностикуму. Нормальну кінську сироватку, досліджувані сироватки та інші рідини абсорбують еритроцитами з метою звільнення від неспецифічних гемагглютининов. З цією метою до одного об'єму досліджуваної біологічної рідини додають 0,1 обсягу осаду відмитих еритроцитів, пробірку з сумішшю струшують і витримують при 37 °С протягом 30 хв, потім центрифугують, видаляють надосадову рідину і використовують у роботі.

Приготування сенсибілізованих еритроцитів включає:

а) одержання еритроцитів. Для цього використовують кров барана, щурів, людини. Кров, отриману з яремної вени, дефибринируют з намистом протягом 20...30 хв і триразово відмивають забуференным фізрозчином. Потім їх стабілізують, піддають танизации і сенсибілізації. В даний час частіше застосовують еритроцити птахів - курей, індиків, качок. Приготовлені з них діагностикуми швидше осідають, що дозволяє скоротити терміни дослідження без втрати чутливості;

б) стабілізація еритроцитів. Перевага стабілізованих еритроцитів в тому, що вони можуть бути заготовлені про запас і тривалий час зберігатися в суспензії, не піддаючись гемолізу. Для стабілізації еритроцитів запропоновано багато методів. Найчастіше використовують формальдегід, глутаровий або акриловий альдегіди. Наводимо один з методів. З осаду відмитих еритроцитів готують 10%-ву суспензію на забуференному фізрозчині рН 7,2. Одночасно готують 0,2%-ний розчин акролеїну на цьому ж розчиннику. З'єднують їх в рівних обсягах і ставлять у водяну баню при 37 °С на 30 хв. Після стабілізації еритроцити тричі відмивають забуференным фізрозчином і ресуспендують в цьому ж розчині до 10%-ної концентрації, розливають по пробірках і зберігають при 2...4 °С. Термін зберігання - 1 рік;

в) танизация еритроцитів. Механізм дії таніну на еритроцити вивчений слабо. Але при цьому досягається головне - танизированные еритроцити володіють значно більшою сорбційною ємністю. Фармакопейний танін повинен мати хорошу розчинністю у воді. Зберігають його в сухому прохолодному місці в посудині, обернутом в чорний папір. Розчин таніну готують безпосередньо перед досвідом. Для цього беруть наважку 0,25 г порошкоподібного таніну і розчиняють у 50 мл забуференного фізіологічного розчину рН 7,2. Отримують розведення 1:200, яке є основним і зберігається на холоді при 2...4 °С протягом місяця. З основного розведення готують робоче (1:20000). До 5%-ної суспензії акролеинизированных еритроцитів на забуференному фізрозчині додають рівний об'єм розчину таніну в розведенні 1:20000. Суміш витримують на водяній бані 20...30 хв при 37 °С. У подальшому проводять відмивання розчином 2-3 рази і осад ресуспендують у фізрозчині до 50%-ної концентрації. Зберігають танизированные еритроцити п ри температурі 2...4 °С. Контроль на їх самоагглютинацию ставлять через 18...20 год після приготування. Для цього в лунці панелі змішують краплю отриманої 2%-ної суспензії танизированных краплю еритроцитів і розчинника. Через дві години еритроцити повинні осісти на дно лунки у вигляді компактної точки. У разі незначної аглютинації танизированных еритроцитів (+ чи ++) суспензію необхідно додатково витримати при 2...4 °С протягом 2...3 діб, після чого повторюють контроль. Якщо еритроцити і в цьому випадку осідають у вигляді "парасольки", то їх вважають непридатними і готують заново.

г) Сенсибілізація еритроцитів. Для цього використовують антисироватки або антигени. До 0,2 мл 50%-ної суспензії акролеинизированных танизированных еритроцитів на фізрозчині додають 0,2 мл розчину антигену або антитіл (концентрація по білку 2 мг/мл) і 0,6 мл фізрозчину. До даної суміші доливають по краплях 1 мл 0,1%-ного розчину хлориду хрому і залишають при кімнатній температурі не більше, ніж на 5 хв. Реакцію зупиняють додаванням 20...50 обсягів 0,02 М фосфатно-буферного розчину рН 7,2, для приготування якого беруть 50 мл фосфатного буфера і 325 мл дистильованої води. Потім тричі відмивають цим же буфером і зберігають у робочій концентрації (2%-а суспензія в розчиннику). Для кон'югації можна використовувати і інші конъюгирующие агенти (глютаровый альдегід, риванол, алізариновий синій).

Отримані таким чином сенсибілізовані еритроцити використовують РНГА.

Основний досвід РНГА. Реакцію ставлять в лунках пластмасових панелей. Останнім часом застосовують микрометод з допомогою приладу Такачи. Досліджувані і контрольні сироватки прогрівають 30 хв при 56 °С. Досліджувані сироватки крові розводять розчинником від 1:2 до 1:256. До кожного розведення додають краплю еритроцитарного діагностикуму. Суміш компонентів струшують і витримують при кімнатній температурі. Облік реакції проводять через 2...3 год, але не раніше повного осадження еритроцитів у контролі (табл.9).

Одночасно ставлять контролі: 1) завідомо позитивна сироватка++++ еритроцитарний діагностикум; 2) завідомо негативна сироватка + еритроцитарний діагностикум; 3) розріджувач + еритроцитарний діагностикум;

3. облік реакції. Реакцію враховують за 4-х бальною системою і виражають в плюсах в залежності від інтенсивності аглютинації.