2. Питання домашнього завдання

1. Збудник лейкозу курей і ВРХ.

2. Сутність РЗГА та затримки гемадсорбции.

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка_____________

Лабораторна робота №11 Тема: Реакція затримки (гальмування) гемаглютинації (рзга, ргга) і затримки гемадсорбції (рзгАд)

Мета: вивчити сутність, техніку постановки РЗГА (РГГА) і РЗГАд.

Обладнання і матеріали: вірус ньюкаслської хвороби з відомим написом, визначеними на попередньому занятті, сироватка крові кролика, імунізованих вірусом Ньюкаслської хвороби, фізіологічний розчин, 0,4...1%-на суспензія еритроцитів курей, пластикові панелі з лунками, пипеточные дозатори, піпетки градуйовані на 1 мл, гумові груші, апарат Киппа, культура клітин, інфікована вірусом, клітинний моношар в нормі, таблиці по темі.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості

Серологічні (serum - сироватка крові) реакції при вивченні вірусів та діагностики вірусних інфекцій набувають все більшого значення. У зв'язку з досягнутими в останні роки успіхами в приготуванні високоочищених антигенів, імунних сироваток, удосконалення самої техніки постановки серологічних реакцій підвищилася їх специфічність і чутливість. Незабаром після відкриття РДА було встановлено, що противірусні сироватки, сполучені з відповідним вірусом, здатні нейтралізувати його гемагглютинирующую активність, тобто затримувати процес гемаглютинації. Однією з найпростіших серологічних реакцій є реакція затримки (РЗГА) або гальмування (РГГА) гемаглютинації.

РЗГА (РГГА) - высокоспецифическая серологическая реакція, що дозволяє вирішити наступні завдання: визначити титр антитіл до гемагглютинирующему вірусу в сироватці; ідентифікувати невідомий гемагглютинирующий вірус по відомо сироватці; встановити ступінь антигенної спорідненості двох гемагглютинирующих вірусів. РЗГА широко використовують для ретроспективної діагностики деяких вірусних інфекцій (грип, парагрип ВРХ, вірусний аборт овець та ін). Для цього використовують парні проби сироваток, взятих з інтервалом в 2...3 тижні, і по приросту титру антитіл в 4 і більше разів визначають захворювання.

Переваги РЗГА: простота техніки постановки, швидкість відповіді, не потрібно стерильної роботи, специфічність, дешевизна. Недолік - РЗГА можлива тільки з гемагглютинирующими вірусами.

Сутність РЗГА полягає в тому, що при взаємодії противірусної імунної сироватки з відповідними штамами вірусу відбувається затримка (гальмування) гемагглютинирующей здатності вірусу. На результат РЗГА впливають неспецифічні інгібітори гемаглютинації, що містяться в сироватках крові. Вони володіють здатністю вступати в зв'язок з вірусами і гальмувати гемагглютинацию. З метою ліквідації негативного впливу інгібіторів на хід реакції їх необхідно зруйнувати (видалити). Для цього використовують кілька методів.

1. Найпростішим є метод звільнення сироваток від неспецифічних інгібіторів з допомогою CO2. З цією метою до одного об'єму сироватки додають 9 обсягів дистильованої води. Пропускання вуглекислоти через цільні або розлучені фізіологічним або гіпотонічним розчинами сироватки не дає частини інгібіторів випасти в осад. CO2 пропускають протягом 5...7 хв з апарату Киппа до інтенсивного помутніння сироватки. Замість газоподібної вуглекислоти можна використовувати шматочки сухого льоду розміром з горошину, які вносять в про-бірку з невеликим інтервалом, щоб уникнути піноутворення; для звільнення від утворилися пластівців мукополісахаридів, що містять неспецифічні інгібітори, пробірки з сироваткою центрифугують при 1500-2000 об/хв протягом 10...20 хв, надосадову рідину відсмоктують і для відновлення фізіологічної концентрації солі додають 8,5%-ний розчин натрію хлориду (1:10 об'єму). Сироватки, оброблені вуглекислотою, не вимагають прогрівання, так як вони звільняються від термостабільних та термолабільних інгібіторів одно-менно. Обробка сироваток CO2 практично не знижує титр специфічних антигемагглютининов.

2. Руйнування інгібіторів фільтратом холерного вібріона. До 1 обсягом прогрітій при 56°С протягом 30 хв сироватки додають 4 об'єму фільтрату холерного вібріона і суміш інкубують протягом 18...20 год при 37 °С. Після цього сироватку знову прогрівають 1 год при 56 °С. Оброблена таким чином сироватка вважається розведеної 1:5.

3. Видалення інгібіторів каоліном. До 0,2 мл сироватки крові додають 0,8 мл фізіологічного розчину, прогрівають при 56 °С протягом 30 хв і додають 1 мл 25%-ної суспензії каоліну на фізіологічному розчині. Суміш струшують і залишають на 20 хв при кімнатній температурі, потім центрифугують 10-20 хв при 2000 об/хв. Після обробки сироватка розведена 1:10. Видалення інгібіторів з допомогою каоліну можна змінити, обробляючи сироватку безпосередньо у панелях для микротитрования. Для цього в 1-ий ряд лунок вносять попередньо про-гретые досліджувані сироватки в об'ємі 0,02 мл 3 додають до них 0,18 мл 12,5%-ної суспензії каоліну. Після збовтування та центрифугування пластини на спеціальній центрифузі здійснюють дворазові розведення абсорбированной сироватки шляхом перенесення петлею з лунки до лунки.

4. Руйнування інгібіторів периодатом калію. Готують 0,05 М розчин периодата калію на дистильованій воді. Для цього 1,15 г периодата калію (KJ04) розчиняють у 100 мл дистильованої води при підігріванні на водяній бані (70...80 °С) протягом 2...5 хв до отримання прозорого розчину. Для руйнування інгібіторів до одного обсягом нерозведеної попередньо прогрітій при 56 °С протягом 30 хв сироватки крові додають один об'єм розчину периодата калію. Суміш залишають при кімнатній температурі на 2 год, потім додають два об'єму 5%-ного розчину глюкози для нейтралізації дії периодата калію (сироватка розведена 1:4).

Компоненти РЗГА: 1-й варіант постановки - досліджуваний вируссодержащий матеріал; діагностична імунна сироватка; 1%-на суспензія еритроцитів; 2-й варіант - досліджувана сироватка крові; стандартний антиген (вірусний діагностикум); 1%-на суспензія еритроцитів.

Постановка РЗГА включає наступні етапи: визначення робочої дози вірусу (1 ГАЇ), визначення правильності вибору 4 ГАЇ та проведення основного досвіду РЗГА. Спочатку в РДА визначають 1 ГАЇ, а для основного досліду використовують від 2 до 8 ГАЇ, частіше всього 4 ГАЇ. Наприклад, якщо 1 ГАЇ вірусу відповідає розведення 1:160, то при підготовці робочої дози (4 ГАЇ) вірус розводять 1:40. Вірус в робочому хіба-деніі готують в обсязі, необхідному для проведення основного досвіду. Для приготування робочого розведення 1:40 беруть 1 мл вихідного вірусу і 39 мл фізіологічного розчину. Правильність приготування робочої дози (4 ГАЇ) визначають в додатковому досвіді. Для цього використовують пластикову панель. В лунки панелі, починаючи з другої і включаючи шосту (контроль), вносять по 0,1 мл фізіологічного розчину. Потім у першу лунку вносять 0,1 мл вируссодержащего матеріалу (4 ГАЇ) і роблять послідовні переноси. З п'ятої лунки 0,1 мл виливають у дезраствор, в контрольну вірус не додають. Отримують розведення вірус-містить матеріалу в 4 ГАЇ, 2 ГАЇ, 1 ГАЇ, 0,5 ГАЇ та 0,25 ГАЇ. Потім у кожну лунку, в тому числі і контрольну, вносять по 0,1 мл 1%-ної суспензії еритроцитів курей. Реакцію залишають при кімнатній температурі на 45...50 хв і проводять облік (табл.7). При правильному виборі 4 ГАЇ в перших двох лунках - аглютинація еритроцитів на 3+, третьої (1 ГАЇ) - 2+, в контролі аглютинація відсутня.

Таблиця 7

Перевірка правильності вибору 4 ГАЇ

Компоненты	Номера лунок
	1	2	3	4	5	Контроль
Физраствор	-	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Вирус	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	в дезраствор
ГАЕ	4	2	1	0,5	0,25
1%эритроциты кур	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Экспозиция 45…50 мин при комнатной температуре
Учет результатов	+++	+++	++	+	-	-

Основний досвід РЗГА (для визначення антитіл в досліджуваній сироватці). В лунки пластмасової панелі розливають по 0,1 мл фізіологічного розчину. Потім у першу лунку вносять 0,1 мл досліджуваної сироватки і роблять послідовні її пе-реносы. З останньої лунки 0,1 мл розведеної сироватки виливають у дезраствор. Таким чином, отримують розведення досліджуваної сироватки від 1:2 до 1:256. У кожну лунку вносять по 0,1 мл вируссодержащего матеріалу в 4 ГАЇ і залишають при кімнатній температурі на 20 хв. Після закінчення цього часу в кожну лунку додають по 0,1 мл 1%-ної суспензії еритроцитів курей і знову залишають при кімнатній температурі.

Одночасно ставлять контроль: а) контроль сироватки (0,1 мл розведеної 1:10 сироватки крові і 0,1 мл 1%-ної суспензії еритроцитів курей);

б) контроль еритроцитів (0,1 мл 1%-ної суспензії еритроцитів курей та 0,1 мл фізіологічного розчину);

в) контроль вірусу (0,1 мл антигену в 4 ГАЇ та 0,1 мл 1%-ної суспензії еритроцитів курей).

Панелі струшують і після 30...60 хв контакту враховують реакцію (табл.8).

Таблиця 8

Основний досвід РЗГА для визначення антитіл

Компоненты	Номера лунок															Контроли
	1	2		3		4		5		6		7		8			Сыв-ки		Эритроцитов			Вируса
Физраствор	0,1	0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1
Исследуемая сыворотка	0,1	0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1			0,1		В.дезраствор
Получаемые разведения	1:2	1:4		1:8		1:16		1:32		1:64		1:128		1:256
Вирус 4ГАЕ	0,1	0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1								0,1
Экспозиция 20 мин при комнатной температуре
1%взвесь эр-цитов кур	0,1	0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1		0,1			0,1		0,1			0,1
Экспозиция 30...60 мин при комнатной температуре
результаты	-		-		-		-		-		+		++		+++			-		-	+++

Облік результатів починають з контролів. Вони повинні показати результат, відображений в табл.8. При наявності відповідних антитіл у досліджуваних сироватках відбувається нейтралізація гемагглютинирующей активності вірусу і затримка аглютинації еритроцитів. У перших лунках спостерігають позитивну РЗГА: еритроцити осідають на дно лунки у вигляді компактної точки. У наступних лунках, де має місце зниження титру антитіл, відзначають негативну РЗГА - аглютинація еритроцитів на 1,2 і 3 плюса. В 1-му і 2-му контролях аглютинація повинна бути відсутня, а в 3-му - аглютинація еритроцитів повинна бути не менш, ніж на 3 плюса.

РЗГА дозволяє не тільки виявити специфічні антитіла, але і визначити їх титр. Титром антитіл в РЗГА називають найменшу їх кількість, здатне повністю затримати гемагглютинацию. У нашому прикладі (табл.8) титр антитіл становить 1:32.

Реакція затримки гемадсорбции (РЗГад).

Її застосовують для виявлення, ідентифікації і типізації вірусів у зараженій культурі клітин.

Суть її полягає в тому, що антитіла імунної сироватки, взаємодіючи з антигеном гемагглютинирующих віруси, що розмножуються в культурі клітин, що екранують, і в результаті адсорбція еритроцитів на поверхні заражених клітин не спостерігається.

Компоненти реакції:1) інфікована і неинфицированная гемагглютинирующим вірусом культура клітин в пробірках; 2) Діагностична противірусна сироватка; 3) 0,4%-ва суспензія еритроцитів курей.

Техніка постановки. З пробірок з культурою клітин зливають живильне середовище, відмивають клітини від її білкових компонентів, додаючи в пробірки 2-3 мл розчину Хенкса. Після 1...2 хв експозиції розчин Хенкса видаляють. Потім в кожну дослідну і контрольну пробірки вносять по 0,2 мл діагностичної сироватки. Пробірки залишають в похилому положенні, смугою вгору, і витримують при кімнатній температурі 15...20 хв. Потім додають по 0,2 мл 0,4%-ної суспензії еритроцитів і знову залишають на 3...5 хв в похилому положенні при кімнатній температурі. Надалі пробірки обережно обертають 5-10 разів з метою ресуспендирования осілих, але не адсорбировавшихся еритроцитів.

Одночасно ставлять такі контролі:

1) контроль культури клітин в нормі (ростову середовище змінюють на підтримуючу);

2) контроль діагностичного (відомого) вірусу (клітинний моношар + вірус);

3) контроль нормальної сироватки (клітинний моношар + нормальна сироватка).

Облік РЗГад проводять під малим збільшенням мікроскопа. При позитивній реакції еритроцити вільно плавають у полі зору. Це обумовлено тим, що гемадсорбирую-

забезпечує здатність вірусу нейтралізована антитілами специфічної сироватки. При негативній реакції відбувається адсорбція еритроцитів на поверхні клітин.