Лабораторна робота № 8 Тема:Зараження, культивування вірусів в організмі лабораторних тварин і їх виділення.

Мета: освоїти різні методи зараження і методику розтину трупів лабораторних тварин, відпрацювати техніку взяття матеріалу для вірусологічного дослідження, навчитися отримувати різні компоненти крові.

Обладнання та матеріали: лабораторні тварини (кролики, білі миші, морські свинки), шприци та інструменти для зараження тварин і взяття крові, вірусовмісний матеріал, трупи лабораторних тварин, пеніцилін, стрептоміцин, хірургічний набір, розчин Хенкса , пробки гумові, Пеніцилінові флакони, стерильні марлеві серветки, колби з намистом, пробірки, колби на 50 мл, лійка, пробірки центрифужні, фізіологічний розчин, штативи, центрифуга, таблиці по темі.

Хід роботи

1 Теоретичні відомості:

Здавна лабораторних тварин застосовують для індикаціі вірусів в патматеріалі, тобто для постановки біопроби. З цією метою суспензією патматериала заражають лабораторних тварин і враховують реакцію на зараження. У вірусологічної практиці для діагностики сказу ставлять біопробу на мишенята, інфекційного бронхіту курей - на курчатах, ящуру - на морських свинках, хвороби Ауєскі - на кроликах і т.д. (табл.4).

Таблиця 4.

Сприйнятливість лабораторних тварин до вірусів

Животные	Вирус	Метод заражения
1	2	3
Мыши	Гриппа человека и животных (лошадей, свиней)	Интраназально
	Хламидии (аборта овец, пневмо­ний, артритов, энцефалитов те­лят)	Интранааально, интра-перитонеально
	Бешенства	Интрацеребрально
	Трансмиссивных энцефалитов лошадей	Интрацеребрально
	Эктромелии (оспы мышей)	Внутрикожно, перито-неально
	Энцефалита Тейлора	Интрацеребрально
	Лимфоцитарного хориоменингита	Интрацеребрально
	Чумы птиц (грипп птиц А1)	Интраназально
Новорожденные мыши	Ящура	Подкожно
	Катаральной лихорадки овец	Интрацеребрально
	Африканской чумы однокопыт­ных	Интрацеребрально
	Лихорадки долины Рифт	Интрацеребрально
	Болезни Найроби	Интрацеребрально
Крысы	Лимфоцитарного хориоменингита	Интрацеребрально
	Эктромелии	Внутрикожно, интра- перитонеально
Хомяки	Гриппа	Интраназально
	Хламидии	Интрахеально
	Бешенства	Подкожно
	Бешенства	Интрацеребрально, подкожно, внутримы­шечно, ректально
Морские свинки	Ящура	Внутрикожно в плантарную поверхность задней лапки
	Осповакцины	Корнеально
	Осповакцины	Интрацеребрально
	Бешенства	Интрацеребрально
Хорьки	Гриппа животных	Интраназально
	Чумы плотоядных	Парентерально
	Инфекционного гепатита собак	Парентерально
Кролики	Коровьей оспы	Корнеально, внутрикожно
	Бешенства	Интрацеребрально
	Хламидии	Интрацеребрально
	Миксоматоза	Парентерально
	Фибромы кроликов	Подкожно, внутримы­шечно, тестикулы
	Болезни Ауески	Подкожно, внутримы­шечно
	Ящура	Новорожденных крольчат внутримышечно
	Ринопневмонии лошадей	Беременных крольчих внутримышечно
Собаки	Чумы собак	Per os внутримышечно
	Инфекционного гепатита собак	Парентерально
Кошки	Энтерита норок	Котят до 15 дней рег, парентерально
	Панлейкемии кошек	Парентерально
Куры	Гриппа птиц	Парентерально
	Ньюкаслской болезни	Парентерально
	Болезни Марека	Парентерально, суточ­ных цыплят интраперитонеально
	Инфекционного бронхита	Интратрахеально,
	Оспы птиц	В перьевые фоликулы, гребень, сережки

Зазвичай ознаки присутності вірусу в організмі тварини малоспеціфічні і не дозволяють зробити висновок про те, який це вірус. Однак, бувають випадки, коли біопроба сопроводжуєтьсяся характерною клінічною картиною, специфічною для визначеного захворювання. Тоді позитивна біопроба дозволяє зробити висновок не тільки про присутність вірусу в патматеріалі, але і його видової приналежності. Наприклад, при свербінні у кролика на місці введення патматеріалу, расчесов і розгризання - зараженя вірусом хвороби Ауєскі.

В даний час лабораторних тварин використовують для:

1) виявлення вірусу в патматеріалі;

2) первинного виділення вірусу з патматеріалу;

3) накопичення вірусної маси;

4) підтримання вірусу в активному стані;

5) титрування вірусу;

6) як тест-об'єкта в реакції нейтралізації;

7) отримання гіперімунних сироваток.

  При виконанні біопроби необхідні лабораторні жі¬вотние різних видів - білі миші, щури, хом'яки, мор¬скіе свинки, тхори, собаки, мавпи, кролики, кури. Лабораторні тварини повинні бути отримані з господарства, благополучного щодо інфекційних та інвазійних захворювань; вони повинні бути клінічно здоровими і мати достатню вагу; до уваги обов'язково беруть вік тварин (в деяких випадках до вірусу найбільш чутливі новородженні, в інших - можна використовувати дорослих).

Тварин перед зараженням витримують в карантині 2 ... 3 тижні. За ними проводять клінічні спостереження і лабораторне дослідження для виключення інфекційних та інва¬зіонних хвороб. Приміщення, де утримуються тварини, повино мати окремий ізольований вхід, достатньо світла, хорошу вентиляцію. Тварин, заражених вірусами, необхідно помістити в окремому приміщенні.

Мітка лабораторних тварин. Мітка є обовязковою умовою використання тварин в експерименті. На клітці закріплють бірку з написом (номер експертизи, кількість заражених тварин, дату зараження та інші відомості).

Існують і способи індивідуальної мітки. Для великих тварин і курей використовують металеві бирки зі штампованим номером. Їх надягають на корінь вуха (кроликам), вставляють у вушну раковину по типу сережки (морським свинкам), надягають на ногу (курям).

Для мітки білих мишей і щурів найчастіше застосовують нанесення кольорових плям на непігментованими шерсть. Насичений розчин пікринової кислоти краще за інших барвників утримується на шерсті і шкірі тварин. Кольорові мітки ставлять в місцях, відповідних певному порядковому номеру тварини. Так, якщо його тіло розділити умовно на три поздовжні частини (лівий бік, спина, правий бік), то нанесення кольорових міток починають з лівого верхньго кута, тобто лопатки; це буде відповідать 1. Рухаючись назад, лівий бік відповідає 2, ліве стегно - 3, далі затилок - 4, спина - 5, область репіци - 6, праве плече - 7, правий бік - 8, праве стегно - 9 . Використовуючи два кольори барвників, можна дати одним з них позначення еді¬ніц, іншим - десятків.

Досліджуваним матеріалом рекомендується заражати відразу декількох тварин разними способами, але з урахуванням тропізму віруса. Оскільки при первинному зараженні тварина може не захворіти, через 5 ... 7 днів здорових на вигляд тварин вбивають, а їхні органи використовують для зараження наступної групи тварин. Зазвичай роблять зазвичай три "сліпих" пасажу.

Вірусовмісний матеріал може бути введений лабораторним тваринам різними методами. Вибір методу зараження визначається тропизмом вірусу. Знаючи тропізм, матеріал вводять в органи, що містять чутливість до цього вірусу клітки. ¬ приклад, вірус грипу вводять інтраназально, вірус сказу - інтрацеребрально.

Застосовують такі методи зараження.

Зараження під шкіру: вірусовмісний матеріал вводять під шкіру в область спини. Доза його для щурів: 0,5 мл, морських свінок- 3 мл, білих мишей - 0,2 мл. Якщо потрібно ввести більшу кількість матеріалу, то рідина інцеюють в різні місця під задній кінець спини або в різних направленях.

Внутрішньом'язове зараження: досліджуваний матеріал вводять у м'яз стегна (у курей - в грудний м'яз). Доза для мишей 0,25 мл, щурів: 0,5 ... 1 мл, морських свинок - 2 мл, кроликів - 5 мл, курей - 3 мл.

Внутрішньошкірне зараження: тонку гостру голку вводять під гострим кутом в складку шкіри, заздалегіть звільнену від волосся. В результаті ін'єкції дол-дружин утворитися бульбашку. Доза вірусовмісного матеріалу для всіх тварин 0,1 ... 0,2 мл.

Нашкірне зараження: на заздалегідь підготовленій (звільненій від шерсті) продезінфікованої шкірі скаріфікатором роблять подряпини, потім краплями наносять вірусовмісний матеріал і втирають скляним шпателем, цей метод широко використовують при роботі з вірусами віспяної групи.

Внутрішньочеревне зараження: тварина фіксують в вертикальному положенні головою вниз. Для ін'єкції використовують затуплені голки. Шкіру, м'язову стінку і очеревину забирают в складку і проколюють їх голкою під прямим кутом до відчуття порожнечі - показник проникнення голки в черевну порожнину. Дози віруссодержащего матеріалу: мишам- 1 мл, крисам- 2 мл, морським свинкам- до 5 мл, кроликам- до 10 мл, вівцям і козам - 50 ... 100 мл.

Внутрішньовенне зараження: досліджуваний матеріал мишам і щурам вводять в хвостову вену, кроликам - у вушну, курям - у вену крила, більш великим тваринам - в яремну вену, морським свинкам- 1 ... 2 мл безпосередньо в серце. У мишей і щурів хвіст треба попередньо занурити на 5 ... 10 хв в теплу воду (48 ... 50 ° С). Голку вводять під гострим кутом в бічну вену задньої третини хвоста. Дози матеріалу: для мишей - 1 мл, щурів - 2 мл, кроликів - до 5 мл, для курей - до 10 мл.

Інтраназальне зараження: стерильною піпеткою в носовий отвір вносять краплю досліджуваного матеріалу, яку тварини при вдиху аспирируют в легені. Матеріал не повинен містити високодисперсних частинок. Наркоз повинен бути глибоким, іншому випадку у тварини виникає чхальний рефлекс матеріалом інфікується навколишнє середовище. Дози: для мишей- 0,03 ... 0,05 мл, щурів: 0,05 ... 0,1 мл, морських свинок і кроликів -до 2 мл.

Внутрішньомозковим зараження: мишей і щурів заражають під наркозом, так і без нього. Введення вірусовмісного матеріалу здійснюють на відстані 1 ... 2 мм від точки перетину середньої лінії черепа з лінією, що з'єднує кути очей. Місце уколу дезінфікують розчином йоду або спиртом. Використовують туберкуліновий шприц з тонкою голкою, на яку надіта гумова муфта так, щоб зріз голки був цілком відкритий. Миша фіксують лівою рукою, відтягуючи шкіру до потилиці. Матерій вводять поступово в дозі: для мишей - 0,025 ... 0,03 мл, для щурів - 0,05 ... 0,1 мл.

Кроликів і морських свинячий, заражають шляхом проколу кістки в області подглазничной борозни. Шкіру при цьому зміщують від середини до борозни, щоб вона після ін'єкції, прийнявши природне положення, закрила отвір у черепі. Голку при ін'єкції тримають похило по відношенню до середньої лінії, виключаючи тим самим потрапляння її в очну ямку. Доза матеріалу 0,3 ... 0,5 мл.

   Після зараження тварини повинні бути поміщені в клетки, на які навішують етикетки із зазначенням вірусу або номера експертизи, кількості заражених тварин, дата зараження. У робочому журналі записують номер експертизи досліджуваного мате¬ріала, кількість і характері стіку заражених тварин, їх маркування, метод введення і дозу вірусу. За тваринами встановлюють спостереження, звертаючи увагу на їх зовнішній вигляд, рухливість, прийом їжі і т.п. Слід зазначити, що загибель тварин у перші дні після зараження може бути зв’язана з травмою або токсичною дією досліджуваного матеріала.

У наступні дні після зараження, ведуть щоденні спостереження за тваринами, контролюючи їх клінічний стан. Так, при розмноженні вірусу в клітинах респіраторного тракту спостерігаються кашель, хрипи, задишка, при розмноженні вірусу в клітинах мозку - судоми, парези, паралічі і т.д. Однак, клінічні ознаки здебільшого носять неспецифічний характер і на цьому етапі досліджень немає можливості прийти до висновку, який саме вид вірусу викликав захворювання. Для цього необхідно провести ідентифікацію виявленого вірусу за допомогою серологічних реакцій.

     Розтин лабораторних тварин. Трупи тварин, полеглих від експериментальної інфекції, негайно розкривають і проводять патологоанатомічне дослідження. Якщо заражене тварина не загинула, його вбивають в момент максимального і. прояви симптомів хвороби або, за їх відсутності, на 3..8 ... 10 день після зараження. Вбити тварину рекомендується надлишкової дозою наркозу, а також шляхом розриву спинного мозку. Для розтину необхідно застосовувати тільки стерильні інст¬рументи: скальпелі, прямі і вигнуті ножиці, ножиці для кісток, пінцети, пастерівські піпетки. Інструменти підбираються так і в такій кількості, щоб у процесі розкриття можна було часто міняти. Основний принцип при розтині - до трупа тварини можна торкатися тільки інструментами або захищеними руками. Дрібних лабораторних тварин (миші, щури, морські свинки, курчата) при цьому приколюють голками в розпростертим вигляді до дошки або кюветі з парафіном, покритими цератою. Можна, використовувати спеціальні столики (ріс.49), забезпечені відповідними фіксують пристосуваннями. Вони повинні бути прикриті клейонкою і встановлені у великих кюветах.

Перед розкриттям труп тварини дезінфікують: дрібних тварин занурюють в 2,5% -ний розчин фенолу на 10 ... 15 хв, великих - обприскують дезрозчином. Розтин проводять зі строгими дотриманням асептики та особистої профілактики. Розріз шкіри роблять по білої лінії живота. Шкіру препарують і відтягують в сторони. Колінні складки і пахвові ямки оголюють для дослідження лімфатичних вузлів. Після цього труп тварини дезінфікують повторно, міняють інструменти і розкривають очеревину і грудну порожнини. Розріз роблять так, щоб не пошкодити шлунок і кишечник. Потім видаляють м'язи живота і очеревину, оголюючи при цьому серце, нирки, печінку, селезінку і знову змінюють інструменти.

В залежності від захворювання у трупа асептично беруть патматеріал. Найчастіше це шматочки паренхіматозних органів, кров, тканини головного і спинного мозку, різні транссудат і ексудати, сеча та ін. Матеріал поміщають в стерильний посуд і заморожують. В обов'язковому порядку проводиться посів на цукрові МПА і МПБ з метою виключення бактеріальної флори.

Після розтину та взяття матеріалу труп, залишки корму, підстилку піддають автоклавуванню або спалюють.

Методи, отримання різних компонентів крові у тварин.

Взяття крові у мишей проводять після їх наркозу. Для цього використовують півлітрову скляну банку з кришкою, в яку кладуть клаптик вати, вливають невелику кількість ефіру для наркозу, поміщають туди миша і закривають кришкою. Наркоз продовжують до тих пір, поки миша втратить здатність утримуватися на ногах. Потім препаровальной голками її приколюють до дошки черевцем вгору, дезінфікують поверхню живота розчином карболової кислоти і роблять поздовжній розріз. Отпрепаровивают шкіру, створюючи ємність, біля передньої лопатки. Стерильними очними ножицями перерізають судини під лопаткою. Кров витікає в ємність, утворену складкою шкіри, її відсмоктують стерильною піпеткою і переносять в неболь¬шую пробірку. Таким чином можна отримати 0,5 ... 1 мл крові.

Взяття крові у морських свинок. На край вуха свинки скальпелем наносять насічки або проколюють ступні. Для попередження швидкого згортання крові вушну раковину покривають тонким шаром парафіну. Так вдається отримати невелику кількість крові. Кров у морських свинок беруть також і пункцію серця. Тварина при цьому фіксують животом вгору. Місце введення голки-область другого міжребер'я, 1 ... 1,5 см від кінця мечевидного відростка. На цьому місці видаляють шерсть і дезінфікують шкіру; відступаючи від лівого краю грудини на 2 мм, вертикальним уколом проколюють грудну клітку. Якщо голка потрапила в по¬лость шлуночка серця, то кров надходить у шприц (10 мл). З серця у великих свинок можна отримати 10 ... 12 мл крові. Після взяття крові морській свинці необхідно ввести такий же обсяг фізіологічного розчину.

Взяття крові у кролика можна проводити з надрізу поверхневої вени вуха. Для цього вищипують шерсть в районі проходження судини і поверхня вуха змащують ксилолом. Лезом бритви або скальпелем роблять надріз вени. Таким шляхом можна отримати до 30 ... 35 мл крові. Після взяття крові жівот¬ному вводять підшкірно фізіологічний розчин, за обсягом в 2 рази перевищує обсяг взятої крові.

Отримання сироватки. Кров після взяття близько години витримують в теплому місці (30 ... 35 ° С), потім згусток її обводять металевою паличкою (відділення згустку від стінок посудини) і ставлять на ніч у холодильник. Сироватку отса¬сивают піпеткою за допомогою груші, переносять у стерильний со¬суд, фільтрують через азбестові фільтри "СФ" і консервують (метріолят натрію, тимол, азид натрію та ін.).

Отримання еритроцитів. Спочатку готують Дефібриновану кров. Для цього в стерилізовану сухою парою толсто¬стенную банку зі скляними бусами беруть кров і постійно струшують, не даючи їй згорнутися. Після закінчення кровопуспуску банку з намистом продовжують струшувати ще 10 хв. Отриману таким чином Дефібриновану кров фільтрують через 2 шари марлі в центрифужні пробірки, центрифугують 10 ... 15 хв при 1500 ..- 2000 об / хв, плазму крові відсмоктують пі-Петко, до осаду еритроцитів доливають фізіологічний розчин , добре все перемішують і знову центрифугують. Еретроціти від сироватки відмивають не менше трьох разів до одержання прозорої надосадової рідини і до використання сохраня¬ют в холодильнику (3-5 днів). Додатково в якості стабілізуючих розчинів від запобігання згортання крові можна використовувати трилон Б, лимоннокислий натрій, гепарин та ін.

Отримання суспензії лейкоцитів. Кров беруть в скляну пробірку, в яку попередньо наливають 5% -ний розчин трилону Б з розрахунку 8 крапель на 10 мл крові. Кров гарненько перемішують. Потім відбирають 3 мл крові з антикоагулянтом і додають до неї цитратний гемостабілізатор (тринатрий цитрат - 13,2 г, лимонна кислота - 4,8 г, глюкоза- 5,0 г, дистильована вода до 1 л) у кількості 1/7 обсягу, тобто 0,4 мл. Цим добиваються підкислення крові до рН 6,5 для зупинення агрегації лейкоцитів з тромбоцитами і гранулоцитами.

Для видалення еритроцитів кров обробляють гіпотоними розчинами. Хороші результати дає 0,83-0,84% -ний розчин хлористого амонію, здатний лизировать еритроцити, не руйнуючи лейкоцити. Розчин готують на трис-НС1-буфері рН 7,6 або дистильованої воді, фільтрують і додають до крові в співвідношенні 9: 1. Лізис еритроцитів настає протягом 2 ... 3 хв. Більш ефективні свіжоприготовані розчини, по¬догретие до 37 ° С. Після лізису еритроцитів суспензію центрі¬фугіруют при 500 об / хв протягом 5 хв так, щоб осіли лей-Коцит, а тіні еритроцитів і комплекси гемоглобіну залишилися в надосадової рідини, яку зливають. Лейкоцити відмивають 2 рази розчином Хенкса і використовують в подальшій роботі.