Лабораторна робота №13 Тема: Реакції нейтралізації (рн).

Мета: вивчити сутність і техніку постановки реакцій нейтралізації .

Обладнання і матеріали: вирусовмісний матеріал (антигени для РН і РІД), специфічна преципитирующая діагностична сироватка (можна використовувати специфічний гамма-глобулін), досліджувані і нормальна сироватки крові, контрольний (негативний) антиген, чутливі тест-об'єкти, 1%-ний агаровий гель в чашках Петрі, пастерівські піпетки, пробійники для вирізання лунок в агарі, пір'я учнівські з ручками, ексикатор з вологою фільтрувальної папером, скла знежирені предметні, розплавлений агар в пробірках, зафіксовані культури клітин покривних стеклах (нормальні і з ЦПД), мікроскопи з освітлювачі і пристосуваннями для дослідження пробірок з культурою клітин, дезінфікуючий розчин, таблиці по темі.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості

Реакція нейтралізації широко використовується у вірусологічній практиці. Вона призначена для ідентифікації виділеного вірусу, визначення наявності антитіл і зміни їх титру в сироватці крові хворих і перехворілих тварин, встановлення кількісного вмісту антитіл у лікувальних, профілактичних та діагностичних препаратах (гамма-глобуліни, діагностичні сироватки).

Сутність реакції нейтралізації полягає в здатності вируснейтралізуючих антитіл імунних сироваток пригнічувати інфекційні властивості вірусу. В результаті цього вірус втрачає здатність розмножуватися і викликати піддаються обліку зміни в чутливою до нього біологічній системі (культура клітин, развирающийся курячий ембріон, організм сприйнятливого лабораторного тварини).

Достоїнствами реакції нейтралізація є її універсальність і висока специфічність. До недоліків відносяться: висока трудомісткість, необхідність суворого дотримання стерильності матеріалів та інструментів, висока вартість тест-об'єктів, необхідність проведення математичних розрахунків, відносна тривалість при постановці реакції. На результати РН, особливо на їх достовірність і відтворюваність, впливають ряд факторів: методика постановки реакції, спосіб і правильність її обліку, концентрація використовуваних сироваток і вірусів, метод розведення компонентів реакції та ін. Вируснейтрализующие антитіла накопичуються в організмі в період одужання (реконвалесценції) і залишаються в ньому тривалий час. Оптимальні терміни для виявлення антитіл в кожному випадку різні і залежать від особливостей імунітету при тієї або іншої інфекції. Наприклад, при грипі свиней мак-симальный титр вируснейтралізуючих антитіл реєструється між 14 і 27-м днями і знижується до 6 місяців. При лейкозі птахів антитіла виявляються через 4 тижні після зараження і зберігаються протягом усього життя.

Сироватки, що застосовуються в РН, повинні бути попередньо звільнені від термолабільних інгібіторів. Для цього їх прогрівають при розведенні не менше ніж два рази протягом 30 хв при 56 °С. Однак, антитіла до деяких вірусів (парагрипу, респіраторно-синцитіальної інфекції) чутливі до нагріванню, тому при постановці РН з такими сироватками його слід уникати.

При зберіганні сироваток титр антитіл поступово знижується. Довго зберігалися сироватки активізують додаванням до них 1/10 обсягу комплементу, що збільшує авідність антитіл. Вируснейтрализующие антитіла добре зберігаються в ліофільно висушеному або замороженому стані (-20 °С).

Для розведення вірусів при постановці РН на лабораторних тваринах або в курячих ембріонах використовують фосфатно-буферний розчин (рН 7,0... 7,2). При роботі з культурами клітин використовують ту середу, яку застосовують в якості підтримуючої для даного виду клітин (середовище 199, 2,5...5%-ний гемогидролизат та ін). Не слід застосовувати розчин звичайної ізотонічного хлориду натрію, оскільки в ньому швидко інактивуються багато віруси.

Залежно від мети дослідження застосовують два варіанти постановки РН: 1 - для ідентифікації і визначення титру вируснейтралізуючих антитіл у досліджуваних сироватках крові (в даному випадку з'єднують рівні об'єми різних розведення сироватки з постійною дозою вірусу); 2 - для ідентифікації та вивчення невідомого вірусу (з'єднують рівні кількості одного і того ж розведення сироватки з зменшувальними дозами вірусу). Результати реакції як у першому, так і в другому варіантах про визначають використанням лабораторних тварин, РКЕ і культур клітин.

Компонентами реакції у 1-му варіанті постановки РН є: досліджувана сироватка, стандартний вірусний антиген, тест-об'єкт, для контрольної реакції - діагностична і нормальна сироватки крові. Реакцію ставлять у два етапи: перший етап - визначення титру вірусу; другий - постановка основного досвіду РН в цьому варіанті.

Для визначення титру вірусу готують 10-кратні розведення вируссодержащего матеріалу, зазвичай з 10-1 до 10-9, так як його титр рідко перевищує зазначену величину. Беруть 9 стерильних пробірок і в кожну з них вносять по 4,5 мл фосфатно-буферного розчину. Потім у першу додають 0,5 мл вируссодержащего матеріалу (розведення 1:10 або 10-1), суміш перемішують і 0,5 мл переносять у другу пробірку (розведення 1:100 або 10-2). З другої - 0,5 мл - третя (10-3) і т. д., користуючись при цьому всякий раз чистою піпеткою. Кожним розведенням ві-руссодержащего матеріалу заражають лабораторних тварин (4 гол.). Обсяг введеного матеріалу залежить від методу зараження, який пов'язують з тропізм вірусу. Наприклад, при зараженні нейротропним вірусом досліджуваний матеріал вводять в мозок, пневмотропным - через ніс, дерматропным - на скарифицированную шкіру або внутрішньошкірно і т. д. За тваринами спостерігають протягом 3...30 днів і більше, залежно від віку та виду тварини та ін. факторів. Найбільше розведення вірусу, що забезпечує загибель половини (50%) заражених тварин, приймають за титр вірусу, позначуваного в даному випадку символом ЛД50 (летальна доза 50% використаних для зараження тварин). Припустимо, вірус в розведенні 104 викликав загибель 50% тварин, це розведення і буде відповідати 1 ЛД5о.Отже, 100 ЛД50 буде відповідати розведення 102 (1:100). Це розведення найчастіше використовують.

Аналогічно визначають титр вірусу на РКЕ за їх загибелі (ЭЛД50 - ембріональна летальна доза) або за патологоанатомічним змін (ЭИД50 - эмбрионинфицирующая доза) у культурі клітин за цитопатичної дії (1 ТЦД50 - тканинна цитопатическая доза).

Постановка реакції. Після встановлення титру вірусу готують дворазові розведення досліджуваної сироватки, починаючи з 1:2 до 1:128 і більше, в залежності від передбачуваного титру вируснейтралізуючих антитіл, в об'ємі 0,5 мл і до кожного розведення сироватки додають по 0,5 мл вируссодержащего матеріалу в розведенні, відповідному 100 ЛД5о - Одночасно ставлять контролі:

а) контроль вірусу (100 ЛД50 вируссодержащего матеріалу з'єднують з фізіологічним розчином в рівних обсягах);

б) контроль імунної сироватки (імунну сироватку в робочому титрі з'єднують з вируссодержащим матеріалом в рівних обсягах);

в) контроль нормальної сироватки (нормальну сироватку з'єднують з 100 ЛД5о вірусу в рівних обсягах),

Пробірки струшують і витримують у термостаті при 37 °С протягом 30...60 хв. Сумішшю з кожної пробірки, в тому числі й контрольних, заражають чутливих лабораторних тварин (4 гол.). Ідентифікацію вируснейтралізуючих антитіл із застосуванням даного тестобъекта проводять при діагностиці ящуру, сказу, лейкозу птахів. Обсяг і місце введення суміші ті ж, що були обрані при визначенні 1 ЛД5о - Терміни спостереження за тваринами аналогічні вищевказаним.

Облік результатів. Спочатку враховують результати контролів. У першому і третьому з них тварини повинні загинути, у другому - залишитися в живих. Якщо досліджувана сироватка містить антитіла, то вони будуть нейтралізувати патогенна дія вірусу і тварина не гине. Однак, сироватку використовують у розведеннях, і, у зв'язку з цим, певною пробірці антитіл виявиться недостатньо для нейтралізації вірусу. Відсоток загибелі тварин буде наростати в напрямку більшого розведення. Все це дає можливість визначити титр вируснейтралізуючих антитіл, який розраховується за методами Ріда і Менча або Кербера. За титр антитіл досліджуваної сироватки приймають те розведення, яке запобігає загибель 50% лабораторних тварин від дії 100 ЛД5о вірусу (табл.10). При використанні РКЕ результат РН враховують по здатності вируснейтралізуючих антитіл сироватки запобігати загибель ембріонів, поява фокусів поразки на хорионаллантоисе і знижувати титр вірусних гемагглютининов у 50% курячих ембріонів. Ці методи застосовуються при визначенні нейтралізуючу активність сироваток по відношенню до вірусів грипу, віспи, хвороби Ньюкасла, інфекційного ларинготрахеїту та бронхіту курей.

Результат РН в культурі клітин оцінюють по здатності вируснейтралізуючих антитіл досліджуваної сироватки в певних розведеннях запобігати розвиток цитопатогенної ефекту (ЦПЭ), що використовується при діагностиці хвороби Ауески, ринопневмонии коней, вірусного гастроентериту свиней, хвороби Тешена, лейкозу птахів та ін. По гальмуванню феномену гемадсорбции до заражених вірусом клітин еритроцитів курки, людини, морської свинки діагностують грип і парагрип.

Таблиця 10

Схема постановки реакції нейтралізації (визначення антитіл на білих мишах)

Компоненты		Номера лунок															Контроли
		1	2		3		4		5		6		7		8		вируса		Имунная сыворотка		Нор-ная сыв-ка
Ф-Б раствор		0,5	0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5
Исследуемая сыворотка		0,5	0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5 в дез раствор				0,5		0,5
Получаемые разведения		1:2	1:4		1:8		1:16		1:32		1:64		1:128		1:256
Вирус в 100 ЛД50		0,5	0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5 в дез раствор		0,5		0,5		0,5
Экспозиция 20 мин при комнатной температуре
Заражения мышей	0,2			0,2		0,2		0,2		0,2		0,2		0,2		0,2		0,2		0,2		0,2
Экспозиция 30...60 мин при комнатной температуре. Выжило/ погибло
Учет рез-ов	4/0			4/0		4/0		3/1		3/1		2/2		1/3		0/4		0/4		4/0		0/4

Титр антитіла = 1:64

Компонентами реакції у 2-му варіанті постановки служать: досліджуваний вируссодержащий матеріал, діагностична (відома), нормальна (негативна) і досліджувана сироватки крові, тест-об'єкт. Цей варіант дозволяє ідентифікувати досліджуваний вірус і визначити індекс нейтралізації (ІВ) спе-цифических і досліджуваних сироваток.

Для постановка РН готують постійні розведення специфічної і нормальної сироваток (зазвичай 1:10) і три ряди 10-кратно відбувають розведення вірусу по 0,5 мл. Останнє розведення вірусу, взятого в досвід, має перевищувати його біологічний титр, так як в противному випадку буде неможливо розрахувати індекс нейтралізації: наприклад, якщо титр вірусу 107 ЕД5о> то досвід слід брати вірус до розведення 10-8 пробірки першого ряду додають специфічну сироватку (1:10) по 0,5 мл, у другий ряд - нормальну сироватку по 0,5 мл, в третій - фізіологічний розчин по 0,5 мл Об'єм сироватки і вірусу повинен бути однаковим. Пробірки струшують і залишають на контакт. Тривалість цього періоду і температуру варіюють залежно від вірусу, з якими проводиться робота. Після інкубації суміш сироватки з розведеннями вірусу в обсязі 0,2 мл вводять в чутливу тест-систему, починаючи з розведення 10-8. Потім проводять облік реакції (табл.11).

Таблиця 11.

Схема реакції нейтралізації для ідентифікації вірусу

Компо­ненты	Разведение вируса									Контроль сыворотток 1:10		Титр вируса, lg		Индекс нейтрализа-ции, lg
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8
Специфи­ческая сыворотка 1:10	+	+	-	-	-	-	-	-	-		2		5
	+	+	-	-	-	-	-	-	-
	+_	-	-	-	-	-	-	-	-
	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Нормаль­ная сыво­ротка 1:10	+	+	+	+	+	+	+	-	-		7		-
	+	+	+	+	+	+	+	-	-
	+	+	+	+	+	+	-	-	-
	+	+	+	+	+	+	-	-	-
Физиоло­гический раствор	+	+	+	+	+	+	+	-	-		7		-
	+	+	+	+	+	+	+	-	-
	+	+	+	+	+	+	-	-	-
	+	+	+	+	+	+	-	-	-

Облік реакції. Якщо відбувається нейтралізація вірусу (немає змін у чуттєвому об'єкті), значить, антитіла діагностичної сироватки специфічні досліджуваного вірусу. Все це дає можливість визначити вид вірусу.

При обліку результатів РН за цим варіантом користуються Е методом визначення індексу нейтралізації за Ріду і Менчу. Індекс нейтралізації являє собою відношення дози вірусу в суміші з нормальною сироваткою, визи-вающей зміни у 50% чутливих об'єктів, до дозі вірусу, що викликає ті ж зміни в суміші з імунною сироваткою. Або, іншими словами, це число, яке показує, у скільки разів специфічна сироватка знижує титр вірусу в порівнянні з нормальною. У нашому прикладі (табл.11):

ІН = Т 1/ Т 2 = 107 / 102 = 105

де Т1 - титр вірусу в присутності нормальної сироватки; Tg - титр вірусу в присутності специфічної сироватки.

Індекс нейтралізації до 10 вказує на відсутність вируснейтралізуючих антитіл в сироватці, від 11 до 49 вважається сумнівним, а 50 і вище - позитивним.

В даний час існують різні модифікації проведення РН. Наведемо деякі з них.

Микрометод РН. Застосовується при діагностиці везикулярного стоматиту, грипу, парагрипу, аденовірусних інфекцій. При даному методі використовують пластмасові пластини, в лунках яких вирощують відповідну культуру клітин (ПЕМ, ФЕК, СПЭВ, ТБ). Потім в лунки вносять дворазові розведення випробуваної сироватки, сполучені з суспензією вірусу в концентрації 100 ТКИД50 (тканинна інфікуються доза) і через 4...7 діб інкубації оцінюють вираженість цитопатичної дії вірусів. Даний метод дозволяє значно знизити витрати досліджуваних сироваток та вірусного діагностичного матеріалу, одночасно дослідити велику кількість зразків сироваток.

Кольорова проба. Суть цієї реакції полягає в здатності вірусу пригнічувати обмінні процеси в заражених клітинах культури тканини. Клітинні суспензії з певною концентрацією клітин додають у пробірку або в лунки пластмасових пластин через годину після внесення в них суміші вірусу з певними розведеннями сироватки. Кольорова проба заснована на тому, що клітини, розмножуючись у незаражених пробірках або пробірки з сумішшю вірусу і нейтрализовавших його антитіл, утворюють багато кислих продуктів обміну, які знижують рН живильного середовища. Це легко виявляють завдяки включеному до складу середовища індикаторному барвнику (наприклад, феноловому червоному), колір якого змінюється в залежності від рН середовища. Червоний колір при рН 7,4.-7,8 стає помаранчевим при рН 7,2, а при зниженні рН нижче 7,0 - жовтим. При загибелі клітин під впливом вірусу не спостерігається виділення достатньої кількості кислих продуктів, тому середовище залишається червоною. Титр вируснейтралізуючих антитіл визначають як останнє розведення сироватки, яке в присутності доданого вірусу дозволило клітинам зберегти нормальні обмінні процеси, а отже, і знизити рН серед до того ж рівня, що і в незаражену контрольній культурі. Зазвичай кольорову пробу широко використовують при роботі з ентеро - та аденовіруси тварин, а також вірусами птахів (хвороби Ньюкасла, інфекційного бурситу, інфекційного синовіту сухожиль, хвороби Марека, інфекційного бронхіту птахів, герпесу індичок).

Метод супернейтрализации. Даний метод використовується для більш точного кількісного виявлення містяться в сироватках антитіл. Він заснований на повторному додаванні індикаторного вірусу, використаного при первісній постановці РН, до всіх проб сироваток, нейтрализовавшим вірус на першому етапі. В результаті знову виникає реакція взаємодії між вірусом і надмірною кількістю антитіл. У пробах з більш низьким вмістом антитіл ця нейтралізація не відбувається або частковою, в результаті чого проявиться ЦПД вірусу на клітини. У пробах з надлишком антитіл ЦПД буде знову відсутній із-за повної нейтралізації вірусу цими антитілами.