Лабораторна робота № 9 Тема: Принципи титрування вірусів в антисироватках.
Мета: відпрацювати різні методики титрування вірусів.
Обладнання і матеріали: тексти завдань по титруванню вірусів для кожного студента.
Хід роботи
Теоретичні відомості
При роботі з вірусами постійно виникає необхідність визначення його кількості в тому чи іншому матеріалі. Без цього неможливі експериментальне зараження вірусами живих лабораторних систем, виробництво вакцин та діагностичних препаратів, оцінка активності противірусних вакцин, отримання імунних сироваток та ін.
Титр вірусу - це кількість вірусних частинок в одиниці об'єму матеріалу. Однак, кількість вірусу неможливо виразити в звичайно вживаних одиницях (обсяг, маса), поетом вдаються до вимірювання в одиницях дії або одиницях активності (інфекційні одиниці). У практиці знайшли застосування два типи одиниць кількості вірусу: 1) інфекційні одиниці локальних пошкоджень, що викликаються вірусами і оцінювані по одиничному ефекту; 2) інфекційні одиниць 50%-го дії вірусів на чутливі живі об'єкти.
Визначення титру вірусу з інфекційних одиниць локальних ушкоджень. З локальних ушкоджень, вызываемы вірусами, відомі бляшки в інфікованих культурах клітин (острівці мертвих клітин у шарі живих) і віспини - некротичні вузлики на ХАО курячих ембріонів. У цих випадках говорять про бляшкообразующих одиницях (БІЙ) і оспинообразующих одиницях (ООЕ). Одна БІЙ дорівнює дозі вірусу, здатної утворити одну бляшку, а одна ООЕ - одну віспин.
Методика визначення зводиться до наступного. Точними об'ємами досліджуваного вируссодержащего матеріалу заражають кілька культур клітин в матрацах або курячих ембріонів в ХАО. Потім підраховують кількість бляшок в кожному матраці і кількість віспин в кожному курячому ембріоні. Розраховують середнє арифметичне. Воно точно дорівнює кількості БОЮ або ООЕ вірусу. Оскільки обсяг заражаючої дози точно відомий, неважко розрахувати, скільки БОЮ або ООЕ припадає на одиницю обсягу вируссодержащего матеріалу. Це і буде титром вірусу в матеріалі.
Наприклад, вируссодержащим матеріалом в розведенні 10-3 заразили 5 ембріонів і отримали 10, 13, 6, 9 і 10 віспин. Середнє арифметичне суми складе 9,6. Титр вірусу в ООЕ визначають за формулою:
а 9,6
Т= --------- = ------------- = 48 000 ООЕ / 0,2 мл
V n 0,2 х 10-3
де а - середня кількість підрахованих віспин; V - обсяг вируссодержащего матеріалу, використаного для зараження; п - ступінь розведення вируссодержащего матеріалу. Отже, виходячи з наших розрахунків, у 0,2 мл вируссодержащего матеріалу в розведенні 10-3 міститься 48000 ООЕ.
Цей приклад титрування вірусів є спрощеним, так як він не враховує випадків високій концентрації вірусу в матеріалі, при якій бляшки або віспини можуть зливатися між собою, і їх неможливо буде порахувати. Зазвичай рахунку піддаються бляшки і віспини, кількість яких не перевищує 50 на матрац або ХАО. Оскільки титр вірусу в досліджуваному матеріалі зазвичай не відомий (він підлягає визначенню),то невідомо, в якому розведенні треба брати матеріал для зараження, щоб уникнути злиття бляшок або віспин.
У цьому випадку готують десятикратні розведення вируссодержащего матеріалу (10-1, 10-2, 10-3 і т. д.) і кожним розведенням заражають рівні групи культур клітин курячих ембріонів Підраховують кількість бляшок або віспин, розраховують середнє арифметичне. Титр вірусу знаходять за формулою:
a1 + a2 + ... +an
T= ------------------------------------
V ( n1 + n2 + ... + nn )
Метод титрування вірусів у БОЮ дає найбільш достовірні дані про їх концентрації, але можуть виникнути технічні труднощі, пов'язані з отриманням і підрахунком бляшок. Що стосується віспин, то їх використання для титрування обмежується досить нечисленними вірусами, здатними утворювати вузлики на ХАО курячих ембріонів.
Визначення титру з інфекційних одиниць 50%-го дії вірусів на чутливі живі об'єкти. Найбільш універсальним є метод визначення титру вірусу в одиницях 50%-го інфекційного дії. За цим методом за одиницю кількості вірусу приймають таку його дозу, яка здатна викликати інфекційний ефект у 50% заражених об'єктів. Вона позначається як ЕД50 - ефективна 50%-ва доза. Число таких доз вірусів в одиниці об'єму матеріалу і є його титр в даному матеріалі.
Але, в залежності від виду об'єкта і характеру його поразки, назва ефективної дози може бути змінена. Якщо виру викликає загибель заражених лабораторних тварин, титр позначають символом ЛД50 (летальна доза 50% використаних для зараження тварин). Якщо ж вірус викликає тільки певні ознаки хвороби, титр позначають ИД50 (інфекційна доза для 50% заражених тварин). При титруванні в курячих ембріонах і загибелі їх титр позначають як ЭЛД50 (ембріональна летальна доза); при обліку лише патологоанатомічних змін в курячому ембріоні - ЭИД50 (ембріон-інфікуються доза); у випадку прояву ЦПД у культурі клітин - ТЦД50 (тканинна цитопатическая доза).
Титр вірусу виражають у кількості інфекційних доз припадають на одиницю об'єму. Наприклад, 103.48 ТЦД50/0.2 мл; 104.5 ЕИД50/0.2 мл; 107.45 ЛД50/0.2 мл
Титрування вірусів по 50%-го інфекційного дії - найбільш універсальний прийом, придатним практично для будь-якого вірусу, якщо підібрати до нього живу систему (тест-об'єкт). Однак, цей метод досить трудомісткий, тривалий і вимагаю статистичних розрахунків. В даному практикумі ми наводимо два методу титрування вірусів по 50%-го ефекту.
1. Метод Ріда і Менча заснований на принципі кумуляції (накопичення). Передбачається, що якщо чутливі об'єкти гинуть після зараження невеликими дозами вірусу, вони обов'язково загинуть і при введенні їм більш концентрованих і навпаки, об'єкти, що залишаються в живих після введення вируссодержащего матеріалу в невеликому розведенні, не загинуть, якщо їх заразити цим же матеріалом в максимальному розведенні. Принцип кумуляції дозволяє штучно збільшувати число досліджуваних об'єктів і тим самим підвищити точність експерименту.
При визначенні титру вірусу з Ріду і Менчу поступають таким чином. З досліджуваної суспензії готують ряд послідовних десятикратных розведень вируссодержащего матеріалу(10-1, 10-2, 10-3, ..., 10-10). Роблять це з двох причин: а) зручність у розрахунках; б) інфекційне дію вірусу зменшується прямо пропорційно його розведення. Вируссодержащим матеріалом у кожному розведенні заражають групу чутливих об'єктів (в кожній групі не менше 4-6) з метою зручності статистичної обробки. За зараженими об'єктами встановлюють регулярне (не рідше одного разу на добу) спостереження і фіксують результат. Зміни в перші 48 год після зараження важко визнати результатом дії вірусу, особливо у високому розведенні, їх вважають неспецифічними і в розрахунок не беруть.
В табл.5 представлена схема титрування вірусу. Вируссодержащий матеріал використаний у 8 розведеннях, кожним розведенням заражене 4 тварин (доза 0,2 мл).
При заражень вируссодержащим матеріалом в розведенні 10-7 не спостерігалося загибелі тварин, отже, летальність тут дорівнює 0, і вижили мишей буде 4. Але до них треба додати тварин, що залишилися живими після введення вірус-містить матеріалу в розведеннях 10-6, 10-5 і т. д. Таким чином, кумулятивне число тих, хто вижив тварин при зараженні вірусовмісним матеріалом в розведенні 10-7 виявиться рівним 12. Активністю вируссодержащего матеріалу в розведенні 10-8 нехтуємо, так як ефект в даному випадку аналогічний такому при дослідженні вируссодержащего матеріалу в розведенні 10-7.
Міркуючи подібним чином, знаходимо значення кумулятивної летальності. Воно становить при розведенні вируссодержащего матеріалу 10-2 12 тварин. Показання, отримані при використанні вируссодержащего матеріалу в розведенні 10-1, з тієї ж причини можна до уваги не приймати.
Вируссодержащий матеріал в розведенні, яке дало ефект вище 50%, позначають буквою В, нижче 50% - літерою А, відсоток летальності відповідно - b і a. Розрахунок проводять за формулою: де В - доза вірусу, що дає ефект більше 50%; А - доза вірусу, що дає ефект менш 50%; b, а - ефект дози відповідно В і А, % ; d - інтервал між двома сусідніми дозами.
Таблица 5
Расчет ЛД50 для мышей по методу Рида и Менча
Вируссодержащий материал в разведениях |
Экспериментальные данные |
Кумулятивные данные
|
||||||
Погибло |
Выжило |
Процент летальности |
Поги-ло |
Выжило |
Отношение числа погибших к числу зараженных |
Процент летальности |
||
|
4 |
0 |
100 |
16
|
0 |
16:16 |
100 |
|
10-2 |
4 |
0 |
100 |
12
|
0 |
12:12 |
100 |
|
10-3
|
3 |
1 |
75 |
8 |
1 |
8:9 |
90 |
|
10-4 (В) |
3 |
1 |
75 |
5 |
2 |
5:7 |
71 (b) |
|
10-5 (А) |
1 |
3 |
25 |
2 |
5 |
2:7 |
28 (а) |
|
10-6 |
1 |
3 |
26 |
1 |
8 |
1:9 |
10 |
|
10-7 |
0 |
4 |
0 |
0 |
12 |
0:12 |
0 |
|
10-8 |
0 |
4 |
0 |
0 |
16 |
0:16 |
0 |
|
10-1Підставляючи у формулу дані таблиці 5 отримаємо:
Таким чином, ЛД50 при зазначеному способі титрування вірусу на мишах дорівнює розведення 10-4,5. Знаючи, що вируссодержащий матеріал використаний в об'ємі 0,2 мл, можна вирахувати концентрацію вірусу у початковій вірусної суспензії. В 0,2 мл цієї суспензії буде міститися 104,5 ЛД50. Значить, титр вірусу буде становити: Т = 104'5 ЛД50/0,2 мл або 5 • 104'5 ЛД50/1 мл Знайдемо абсолютне значення розведення, відповідне 1 ЛЛ50. У розрахунок беруть цифру 4,5. Число 4 показує, що
абсолютній цифрі повинно бути 5 знаків (4 + 1). А антилогарифм цифри 4,50 становить 3162. Але оскільки в ній тільки 4 знака означає п'ятий знак приписують у вигляді 0 і отримують 31620. Отже, для нашого прикладу 1 ЛД50 дорівнює розведення вірусу 1:31620.
2. Метод Кербера. Цей метод вважається більш простим, не вимагає розрахунку кумулятивних даних, придатний і у випадках позитивного ефекту від неспецифічних причин. Але для отримання достовірних результатів необхідно, щоб позитивні дані були відомі в діапазоні від 0 до 100%.
Розрахуємо ЛД50 для результатів, наведених в табл.5.
Розведення вірусу Вижило Пало
10-1 0 4
10-2 0 4
10-3 1 3
10-4 1 3
10-5 3 1
10-6 3 1
10-7 4 0
10-8 4 0
ЛД50 вираховуємо за формулою:
де D - вища розведення вірусу, ще дає 100%-ний ефект; d - коефіцієнт розведення; п - кількість заражених тест-об'єктів на кожне розведення; r - кількість позитивно реагуючих тест-об'єктів на кожне розведення;
- сума відносин позитивно реагуючих тест-об'єктів до зараженим для всіх розведень, що дають ефект від 0 до 100%.
Підставляємо в формулу значення, отримаємо
Отже, в 0,2 мл вірусу, розведеного 10-4,5, міститься одна ЛД50 вірусу. Далі міркуємо так само, як і при розрахунку за Ріду і Менчу. Якщо lg ЛД50 = -4,5, то ЛД50 = 10-4,5 або 1:104,5. Значить, в 0,2 мл вірусу, розведеного 1:104,5, міститься 1 ЛД50, а в 0,2 мл вихідного вірусу міститься таких доз більше в 104,5 рази, тобто 104,5 ЛД50. Значить, титр вірусу в нашій, суспензії Т = 104,5 ЛД50/0,2 мл, або 1 ЛД50 дорівнює розведення вірусу 1:31620.
Титри гемаглютинирующих вірусів можна визначити РДА .
Титрування антитіл. При титруванні антитіл імунних сироваток використовують два методи:
1) визначення індексу нейтралізації випробуваної сироватки ;
2) визначення максимального розведення випробуваної сироватки, яке нейтралізує дію стандартної дози вірусу (див. РЗГА, РН та ін реакції)