2. Питання домашнього завдання

1.Віруси хвороби Тешена і гастроентериту свиней.

2.Сутність РСК.

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка_______________

Лабораторна робота №15 Тема: Реакція зв'язування комплементу (рзк)

Мета: вивчити особливості і техніку постановки РЗК.

Обладнання і матеріали: досліджувані сироватки, стандартний вірусний діагностикум (антиген), діагностичні сироватки (специфічні імунні сироватки), гемолизин, комплемент, 2,5%-ва суспензія еритроцитів барана, штативи, пробірки, піпетки на 1, 2 і 5 мл, термостат, таблиці по темі.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості.

Реакція зв'язування комплементу (РСК) - один із найцінніших методів, наявних у розпорядженні вірусолога. По чутливості ця реакція поступається реакцій нейтралізації, гальмування гемаглютинації або методом флуоресціюючих антитіл, проте вона має і ряд переваг. По-перше, вона набагато простіше. По-друге, за допомогою реакції зв'язування комплементу можна виявити деякі вірусні антигени, що не володіють инфекционностью або гемагглютинирующей активністю, наприклад так звані «розчинні» антигени миксовирусов, капсиди ентеровірусів, а також «неоантигены», утворювані деякими онкогенними вірусами. Виявлення комплементсвязывающих антитіл - один з найцінніших методів діагностики вірусних інфекцій. Справа в тому, що комплементсвязывающие антигени багатьох вірусів мають груповий специфічністю. Так, наприклад, розчинні антигени різних штамів вірусів грипу А і В мають груповий, а не штамової специфічністю. Аденовіруси також містять груповий комплементсвязывающий антиген. Комплементсвязывающие антигени групової специфічності утворюють і деякі арбовіруси. Очевидно, що групова специфічність вірусних антигенів виключає можливість використання цього тесту для більш детальної діагностики - встановлення типової приналежності вірусу. Тим не менш РСК є дуже цінним методом масової діагностики, так як в подібних випадках в першу чергу потрібно встановити групову належність вірусу. При бажанні тип вірусу можна встановити за допомогою більш специфічних серологічних методів. При природних захворюваннях, що викликаються деякими іншими вірусами, наприклад коксакі або ECHO, також утворюються гетерологичные антитіла, однак це явище спостерігається не настільки регулярно, щоб на його основі можна було ідентифікувати групову належність вірусу. Тому в разі захворювань, що викликаються цими агентами, діагностична цінність РСК невелика. Особливу цінність представляє РСК для вивчення антигенних взаємозв'язків між вірусами. Реакція зв'язування комплементу (РСК) широко використовується в діагностичній практиці для виявлення специфічних комплементсвязывающих антитіл у досліджуваних сироватках крові і для визначення виду або типу вірусу. Її застосовують для діагностики багатьох вірусних інфекцій (ящуру, енцефаломієліту коней та ін). Суть реакції полягає в тому, що тут беруть участь дві системи: специфічна (досліджувана сироватка + антиген) і індикаторний (гемолітична сироватка або гемолизин + суспензію еритроцитів барана). Сполучною компонентом між ними є комплемент. В залежності від того, де він адсорбується, спостерігають той чи інший результат реакції. Якщо комплемент використовується у специфічній системі - реакція позитивна, індикаторної - негативна . Позитивна реакція характеризується затримкою гемолізу (еритроцити знаходяться у суспензії - рідина каламутна, червоного кольору), негативна - повним гемолізом (лізис еритроцитів - рідина прозора, червоного кольору. Компоненти реакції наступні: досліджувана сироватка крові (досліджуваний антиген), стандартний вірусний антиген (стандартна сироватка), гемолітична сироватка або гемолизин, еритроцити барана, комплемент. В якості розчинника іс-користовують ізотонічний розчин хлориду натрію (рН 7,2... 7,4) або різні буферні розчини.

Р ис. Реакція зв'язування комплементу: а - позитивна (затримка гемолізу); б - негативна (гемоліз)

Постановка РЗК при вірусних інфекціях значно відрізняється від постановки її при бактеріальних інфекціях. Це зумовлено рядом специфічних властивостей вірусів.

1. Для звільнення вірусного антигену доводиться обробляти інфекційний матеріал з метою вилучення його з клітки.

2. Вірусні антигени не відрізняються високою стійкістю, тому матеріал для їх отримання беруть від полеглих тварин в перші години загибелі, а краще за життя. Консервування вируссодержащего матеріалу часто не дає позитивних результатів, так як багато хто з них викликають руйнування вірусного антигену.

3. Нерівномірність фіксації комплементу при різному співвідношенні концентрацій антиген-антитіло. Комплекс антиген + антитіло утворюється тільки при суворих кількісних співвідношеннях цих компонентів. При надлишку антитіл фіксація комплементу різко знижується. То ж спостерігають і при надлишку антигену, де придушення фіксації відбувається ще швидше. Тому для встановлення оптимальної дози комплементу необхідно попереднє титрування антигену та антитіла.

4. Незначний обсяг комплексу антиген-антитіло. Розмір вірусних частинок, що вступають в цей комплекс, а отже, і площа фіксації комплементу невеликі. Зі збільшенням обсягу комплексу антиген-антитіло шляхом подовження періоду фіксації компонента підвищується чутливість реакції, але знижується її специфічність, так як збільшується фіксація комплементу неспецифічними тканинними антигенами.

5. Висока комплементарна активність вірусних антигенів. У своєму складі вони містять тканинні антигени, що заважає проведенню реакції (неспецифічна фіксація комплементу). Для виключення цього явища необхідна більш повна очищення вірусних антигенів від тканинних фрагментів.

Крім того, суттєвою перешкодою для РСК при діагностиці вірусних захворювань тварин і людини є нерівномірне накопичення антигена і антитіл в різні періоди хвороби і особливо при різних інфекціях. Тому постановка РЗК повинна мати особливості не тільки в залежності від характеру захворювання, але й від її мети (виявлення антигену, антитіл, титрування вірусу і т. д.).

Для підвищення чутливості РСК потрібна деяка зміна методики її постановки - зв'язування комплементу В РСК при вірусних інфекціях проводять довгостроково (18...20 год) і на холоді (Про...4 °С). В цих умовах антиген і антитіло встигають відреагувати найбільш повно, що підвищує чутливість реакції. Однак, незважаючи на труднощі постановки РЗК, ця реакція знайшла застосування для виявлення вірусу в досліджуваному матеріалі. Типовим прикладом може бути постановка РЗК для виявлення вірусу ящуру, визначення його типу та варіанту,

Антигени і пропоновані до них вимоги: 1) досить висока антигенна активність; 2) відсутність домішок антигенів організму господаря; 3) відсутність компонентів, володіють антикомплементарной активністю; 4) безпеку щодо поширення інфекції і нешкідливості для працюючого персоналу; 5) хороша зберігання при різних температурних режимах; 6) стандартність антигену.

Приготування антигенів. Інфекційний матеріал звільняють від грубих тканинних частинок, подрібнюють ножицями і розтирають у ступці з кварцовим піском, розбавляють буферним розчином і центрифугують. Надосадову рідину відсмоктують і піддають подальшій обробці. Ця обробка переслідує наступні цілі: максимальне звільнення вірусу з клітин, видалення клітинних матеріалів і руйнування прокомплементарной активності.Вірусні матеріали для антигенів беруть з органів і тканин природно або експериментально заражених тварин з урахуванням тропізму вірусів і термінів вирусовыделения. Антигени можна отримувати із заражених курячих ембріонів та культури клітин з урахуванням стадії репродукції вірусу і особливостей його накопичення в клітинах або внеклеточно в живильному середовищі. Однак, в будь-якому випадку в препаратах антигенів відносно багато матеріалу клітин господаря. Такий матеріал потенційно здатна-бен взаємодіяти з антитілами. Тому завжди необхідно ставити контрольну реакцію з антигеном, отриманими з аналогічною незаражену тканини. Таким чином визначають наявність в препараті антигенів клітин господаря. Їх кількість можна зменшити, очистивши препарат з допомогою центрифугування в градієнті щільності, хроматографією на колонці або шляхом впливу фторуглеродных сполук або органічних розчинників (ацетон, ефір, хлороформ). Деякі антигени мають антикомплементарной активністю, тобто здатні самі по собі пов'язувати або руйнувати ті чи інші компоненти комплементу. Видаляти матеріал, що володіє антикомплементарной активністю, рекомендується з допомогою фторуглеродистых сполук або обробляючи його про-гретым комплементом морської свинки.

Приготування сироваток. Для отримання сироваток, що містять комплементсвязывающие антитіла, лабораторних тварин піддають або імунізації за певними схемами, або зараження інфекційним агентом. Введення активного вірусу передують дві-три ін'єкції формалинизированной суспензії. Після отримання сироватки титрують (визначають кількість антитіл), а потім лиофилизируют або консервують. Ліофільно висушені сироватки можна зберігати в умовах холодильника до 4-х років. Для консервування сироваток найбільш зручним і загальнодоступним засобом є фенол. Готують 5%-ний розчин фенолу на фізрозчині і додають в сироватки з розрахунку 1:9. Додавання проводять по краплях при постійному перемішуванні. Фенолизированные сироватки фасують по ампулам і зберігають в умовах холодильника протягом року. Всі сироватки, використовувані в РФК, перед досвідом обов'язково інактивують протягом 30 хв: сироватки морської свинки і кролика при 56 °С, щурів - при 60 °С, собак - 65 °С, мишей - 60 °З, великої рогатої худоби - 56...58 °С, коней та овець-58-60 °С.

Сироватки, як і антигени, теж мають антикомплементарностью, тобто здатністю зв'язувати комплемент у відсутність антигену і тим самим затримувати гемоліз. Вона може бути обумовлена як тривалим зберіганням сироваток, так і властивістю, властивим деяких тварин (наприклад, кроликам). Тому сироватки потрібно зберігати в стані глибокої заморозки або ліофільно висушеними. Крім того, слід ретельно відокремлювати сироватку від згустка, не захоплюючи еритроцитів. Для усунення антикомплементарности їх прогрівають при температурі 1-2 °С вище необхідної для інактивації комплементу, або замораживют при мінус 20...70) °с З подальшим видаленням осаду центрифугуванням. Хороші результати дає обробка сироваток вуглекислотою (див. РЗГА) або комплементом морської свинки. Для цього до 3-м обсягами сироватки додають 1 обсяг комплементу морської свинки, суміш інкубують протягом ночі при 4 °С, а потім 30 хв при 37 °С. Після цього сироватку розбавляють 1:4 або 1:8 буферним розчином і інактивують при 60 °С протягом 30 хв.

Еритроцити. Зазвичай при постановці реакції застосовують еритроцити барана. Їх отримання описано у занятті 12. Для тривалого зберігання останнім часом широко використовують розчин Альсевера. При змішуванні 2 частин крові і 1 частини цього розчину еритроцити зберігаються при 4 °С протягом 4-6 тижнів.

Розчин Альсевера готують по наступному рецепту: декстрози - 20,5 г, цитрату натрію - 8,0 г, лимонної кислоти - 0,55 г, хлористого натрію - 4,2 г, дистильованої води - до 100 мл; рН розчину 6,1. Розчин автоклавують при 0,06 МГГа протягом 10 хв або пропускають через фільтр Мілліпор та інші з раз-мером пор 0,22 мкм.

Комплемент випускають біофабрики в ліофілізованому вигляді. Але його можна отримати в будь-якій лабораторії. Для цього у морських свинок з серця беруть кров, поміщають її в термостат на 30 хв, відокремлюють згусток стерильної спицею і витримують ніч у холодильнику. Потім сироватку збирають пастерівської піпеткою і консервують, додаючи до 10 мл її 0,2 г борної кислоти і 0,3 г сірчанокислого натрію. Комплемент зберігається до 2-х тижнів в холодильнику в замороженому стані. Його титрують кожен раз в день постановки головного досвіду.

Гемолизин - сироватка крові кролика, імунізованих еритроцитами барана, Гемолизин випускають біофабрики в сухому вигляді.

Виявлення та ідентифікація вірусу ящуру в РЗК. РСК з 100%-ного гемолізу застосовують для визначення типів і варіантів вірусу ящуру. РСК ставлять в різних обсягах: якщо загальний об'єм 1 мл - кожен компонент беруть в об'ємі 0,2 мл; загальний обсяг 0,5 мл - кожен компонент беруть в об'ємі 0,1 мл

Для приготування антигену стінки афт від хворих тварин відмивають від консервуючої рідини фізіологічним розчином, висушують фільтрувальним папером, зважують, подрібнюють і ретельно розтирають в ступці з піском, додають подвійне по відношенню до маси афт кількість фізіологічного розчину. Отриману суспензію екстрагують при кімнатній температурі протягом 2 год, заморожують до мінус (10...20) "С протягом 5...18 год. Після розморожування центрифугують. Надосадову рідину інактивують 40 хв при 58 °С і використовують в якості антигену РСК.

Методика постановки РЗК наступна

1. Титрування гемолизина. Гемолизин титрують при отриманні його нової серії. Випускає

мий биофабриками гемолизин часто консервирован гліцерином (1:1). Спочатку готують основний розведення 1:100. Для цього беруть 0,2 мл гемолизина і 9,8 мл фізрозчину. З нього готують розведення 1:1000-1 мл гемолизина 1:100 додають 9 мл фіз. розчину. З основного розчину (1:1000) готують всі наступні за зазначеною нижче схемою (табл.12). Отримавши необхідні розведення гемолизина, проводять його титрування (табл. 13).

Схема приготування розведенні гемолізи на

Компоненты, мл	Разведения
	1:1500	1:2000	1:3000	1:4000	1:5000	1:6000	1:7000	1:8000
Гемозолин 1:1000	1,0	1,0	1,0	1,0	1.0	1,0	1,0	1.0
Физраствор	0,5	1,0	2,0	3,0	4,0	5,0	6,0	7,0

Таблица 13

Схема титрування гемолізина

Компонен­ты, мл	Разведения
	1:1000	1:1500	1:2000	1:3000	1:4000	1:5000	1:6000	1:7000
Гемолизин	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Физраствор (вместо антиге-на и сыворотки)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Компле­мент 1:20	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
2% взвесь эри­троцитов	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Водяная баня 10 мин при 37 °С
Учет тит­рования	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧЗГ	ЗГ	ЗГ	ЗГ

Позначення: ПГ - повний гемоліз; ЧЗГ - часткова затримка гемолізу; ЗГ - затримка гемолізу.

При цьому необхідні такі контролі: 1) контроль еритроцитів для виключення спонтанного гемолізу (0,5 мл 2%-ної суспензії еритроцитів + 2 мл фізіологічного розчину); 2) контроль гемолизина для виключення гемолізу еритроцитів без комплементу (0,5 мл розведення 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2%-ної суспензії еритроцитів + 1,5 мл фізіологічного розчину); 3) контроль комплементу для виключення гемолізу еритроцитів без участі гемолизина (0,5 мл 1:20 комплементу + 0,5 мл 2%-ної суспензії еритроцитів + 1,5 мл фізіологічного розчину); 4) контроль гемолітичної системи (0,5 мл розведення 1:1000 гемолизина + 0,5 мл 2%-ної суспензії еритроцитів + 0,5 мл розведення 1:20 комплементу - 1мл фізіологічного розчину).

При титруванні встановлюють граничний титр гемолизина, тобто його мінімальна кількість, здатне викликати лізис еритроцитів у присутності комплементу. У нашому прикладі (табл.13) - це кількість гемолизина в розведенні 1:3000. У перших трьох контролях повинна бути повна затримка гемолізу, в четвертому контроль - повний гемоліз.

У головний досвід беруть 4-х-кратну концентрацію гемолизина від його граничного титру. Отже, робоче розведення 1:750. А якщо він консервирован гліцерином (1:1), то для приготування робочого розведення беруть 2:750 або 0,2 мл цільного гемолизина і 74,8 мл фізіологічного розчину.

2. Приготування гемолітичної системи. Змішують гемолизин в робочому титрі з рівною кількістю 2%-ної суспензії еритроцитів барана. Перед використанням гемолітичну систему витримують в термостаті 30 хв при 37 °С для сенсибілізації еритроцитів.

3. Приготування 2%-ної суспензії еритроцитів. До 2 мл осаду відмитих еритроцитів барана додають 98 мл фізіологічного розчину.

4. Титрування комплементу. Комплемент титрують в гемолітичній системі в день головного досвіду за схемою, наведеною в (табл.14).

Таблиця 14

Схема титрування комплемента

Компоненты, мл	Содержание цельного комплемента, %
	0 0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0	4,5
Комплемент 1:20	0 0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45
Физраствор, недостающий до 0.5 мл	00,45	00,4	00,35	00,3	00,25	00,2	0,15	00,1	0,05
Гемолитическая система	11,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Физраствор (вместо антигена и сыворотки)	11,0	1,0	1,0	11,0	11.0	11,0	1,0	11,0	11,0
Водяная баня 15 мин при 37...38 °С
Учет титрования	ЗГ	ЗГ	ЗГ	ЧЧЗГ	ПГ	ППГ	ПГ	ППГ	ППГ

Позначення: див. табл.13.

Титром комплементу вважають його найменша кількість, яке викликає повний гемоліз еритроцитів. При визначенні типу вірусу ящуру використовують комплемент з титром не нижче 2,5 %.

Для постановки головного досвіду РСК комплемент беруть з надлишком в 1% або в дві умовні одиниці від його титру в гемсистеме. Наприклад, титр комплементу в гемсистеме 2 %, головний досвід беруть 3 %. Для приготування робочої дози до 3 мл нативного цілісного комплементу додають 97 мл фізіологічного розчину.

Приготування розведення комплементу, визначення його активності та обчислення робочої дози вимагають у підготовці РСК найбільшої уваги. Правильно обрана робоча доза комплементу - неодмінна умова нормального перебігу реакції, що забезпечує достовірність результатів.

При визначенні типу вірусу ящуру типоспецифические сироватки і стандартні антигени, що випускаються биофабриками, використовують у подвоєному граничному титрі. Наприклад, якщо титр сироватки, зазначений на етикетці, дорівнює 1:40, робочий титр дорівнює 1:20.

5. Постановка головного досвіду. Одночасно з головним досвідом ставлять контроль всіх специфічних ящурних антигенів і сироваток згідно зі схемою (табл.15). Компоненти розливають в такому порядку:

1) специфічні сироватки в робочому титрі по 0,2 мл для кожної сироватки - один ряд по вертикалі;

2) специфічні антигени у робочому титрі по 0,2 мл - у перші сім рядів по горизонталі, для кожного антигену один РЯД;

3) випробуваний антиген в розведеннях по 0,2 мл - для кожного розведення один ряд пробірок по горизонталі;

4) фізіологічний розчин по 0,2 мл - в останній ряд по горизонталі (контроль сироваток) замість антигену і в останній ряд по вертикалі (контроль антигенів) замість сироваток;

5) комплемент по 0,2 мл в робочому розведенні - у всі пробірки головного досвіду.

Пробірки обережно струшують і поміщають у водяну баню на 20 хв при 37...38°С.

6) у всі пробірки наливають по 0,4 мл гемолітичної системи. Пробірки знову струшують і ставлять у водяну баню на 30 хв при 37...38 °С.

Облік реакції проводять через 5-10 хв після водяній лазні і остаточний результат отримують через 10-12 год. Ступінь затримки гемолізу оцінюють в плюсах:

++++ - 100%-ва затримка; +++ - 75%-ва затримка;

++- 50%-ва затримка; +- 25%-ная затримка; - повний гемоліз.

Якщо випробуваний антиген гомологічний специфічним антитілам, то буде затримка гемолізу і реакція вважається позитивною: якщо ж гомологічні антитіла відсутні - реакція негативна і спостерігається повний гемоліз.

При виробничій необхідності після визначення типової приналежності вірусу ящуру встановлюють його варіант. Для цього ставлять РСК за тією ж методикою, але використовують варіантні сироватки і антигени встановленого типу. Причому варіантні сироватки використовують в граничному титрі, а антигени - у подвоєному.

Микрометод РСК. Останнім часом для кількісного обліку РСК застосовують техніку постановки реакції у малих обсягах, Для цього використовують набори панелей з V-подібною конфігурацією лунок і каліброваних крапельних піпеток системи Такачи. Реакцію ставлять в обсязі 0,125 мл, тобто в 8 разів меншій, ніж при описаному вище методі. Кожен компонент беруть в обсязі 0,025 мл

Примітка: всі стандартні антигени і сироватки активні і специфічні. Випробуваний антиген відноситься до типу А.

Техніка підготовки реагентів, приготування стандартів і постановка реакції такі ж, як і при макрометоде. Невеликий витрата реагентів і швидкість розливу компонентів краплинними микропипетками роблять микрометод дуже зручним при постановці перехресних реакцій, коли визначають антигенна спорідненість декількох штамів.