2. Питання домашнього завдання
1. Віруси хвороби Ауєскі та сказу.
2. Призначення і сутність РКОА3. Компоненти РКОА. Схема постановки та обліку РКОА.
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка________________
Лабораторна робота № 16 Тема: Реакція коагглютинації (ркоа)
Мета: вивчити сутність, техніку постановки та обліку РКОА.
Обладнання і матеріали: добова агаровая культура золотистого стафілокока (штам Cowan-1), рідка пептонно-дріжджова середа, центрифуга, фосфатно-буферний розчин рН 7,2...7,4, 0,3...3%-ний розчин формальдегіду, антитільний еритроцитарний діагностикум для протеїну А стафілокока, 0,1%-ний розчин бичачого сироваткового альбуміну, мертиолят натрію, досліджувані біологічні рідини, микропанели для титрування, апарат Такачи, таблиці по темі.
Хід роботи
Теоретині відомості.
Реакція коагглютинації (РКОА) знаходить широке застосування для ідентифікації вірусів грипу, герпесу, онкогенних вірусів, ротавірусів та ін. Гідності РКОА: а) висока економічність (50-250 разів дешевше інших методів); б) висока чутливої шкіри -
остюк, не поступається в ряді випадків ІФА; в) простота постановки (відсутність необхідності в дорогому обладнанні для приготування реагентів та обліку реакції).
Рис.68. Принцип реакції коагглютинації: 1 - золотисті стафілококи (штам Cowan-1); 2 - білок А; 3 - Fc-фрагмент антитіл; 4 - Fob-фрагменти антитіл; 5 - антиген; 6 - феномен коагглютинации
Сутність РКОА полягає в тому, що білок А (видоспецифический протеїн) золотистого стафілокока має здатність з'єднуватися з Fc-фрагментом IgG людини і ряду ссавців, у т. ч. лабораторних тварин - продуцентів антитіл (кроликів, морських свинок, щурів, мишей, кіз тощо). Білок А здатний реагувати не тільки з вільними молекулами імуноглобулінів, що знаходяться в розчині, але і з імуноглобулінами, фіксованими на клітинних поверхнях, які перебувають у складі імунного комплексу. При цьому Fab-фрагменти залишаються вільними для реакції з гомологічними антигенами (рис.68).
У постановці даної реакції модно виділити три основних етапи: 1) отримання активної та стабільної за вмістом білка А суспензії золотистого стафілокока; 2) визначення вимог до імунної сироватки, що використовується для сенсибілізації стафілокока, а також правильне проведення процесу сенсибилиза-ції; 3) постановка реакції і облік її результатів.
Отримання суспензії золотистого стафілокока. Присутність білка А є видоспецифічні ознакою золотистого стафілокока, проте в якості продуцента частіше використовують St. aures (штам Cowan-1), найбільш багатий цим білком. Приготування реагенту для коагглютинации полягає в попередній обробці клітин для кращого закріплення на їх поверхні білка А та попередження втрати активності при тривалому зберіганні суспензії.
Добову агаровую культуру золотистого стафілокока засівають в рідку пептонно-дріжджову середовище і вирощують протягом 12.„14 год при посиленій аерації (струшування на шуттельаппарате при 100 поштовхів за хв). Скорочене час культивування забезпечує максимальне накопичення білка А в клітинах. Пептонно-дріжджову середовище готують по наступному рецепту:
пептон - 10 г, дріжджовий екстракт - 5 г, глюкоза - 2 г, двузамещенный фосфат калію - 3 г, дистильована вода - 1л. Середовище стерилізують протягом 30 хв при 0,05 МПа, рН після цього становить 7,2-7,4. Посівна доза - змив з одного косяка на 2 л живильного середовища.
Бактеріальні клітини осаджують центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 15 хв і двічі відмивають від живильного середовища фосфатно-буферним розчином (ФБР) з рН 7,2.-.7,4. З осаду готують 10%-ву суспензію на ФБР. Цю суспензію мікробів фіксують 1%-ним розчином формальдегіду протягом 3 год при постійному перемішуванні. Потім бактеріальні клітини чотири рази відмивають ФБР від формальдегіду, суспензію розводять до 10 %-ної концентрації і прогрівають при 60 °С протягом 1 год для зниження протеолітичної активності. Потім клітини ще раз промивають, суспендують у ФБР, додають мертиолят натрію (1:10000) і зберігають до 2-х місяців при 4...6 °С. Більш тривале зберігання в рідкому вигляді небажано, так як може знизитися активність білка А.
Необхідна умова успішної обробки стафілококових клітин - перевірка біологічної активності білка А на всіх етапах. Для цієї мети запропоновано декілька препаратів. Всі вони являють собою еритроцити або частинки латексу, сенсибілізовані гамма-глобулінової фракції сироватки крові. За ступенем аглютинації навантажених частинок визначають титр білка А. Досить активними вважають стафілококові препарати з титром 1:2000 і вище. Методика приготування еритроцитарного діагностикуму і постановка РНГА - див. тему "РНГА". Оброблені клітини золотистого стафілокока носять назву "стафілококовий реагент".
Сенсибілізація стафілококів. Для отримання коагглютинирующего реагенту суспензія стафілококів обробляють імунною сироваткою проти шуканого об'єкта дослідження. Сироватку слід брати від тварини, IgG якого мають срод-ством до білка А стафілокока. Найбільш активні по відношенню до нього імуноглобуліни людини, свині, собаки і морської свинки, менше - осла і кролика, а IgG вівці, коні, кози, щури та миші взаємодіють з ним дуже слабо.
Сироватка повинна бути строго специфічною, тобто не містити антитіл до інших компонентів вируссодержащего матеріалу. Це досягається високим ступенем очищення вірусу, що використовується для імунізації, або абсорбцією сироватки неінфікованій культурою тканини, на якій отримано вірус, або поєднанням обох цих методів.
Сироватка, використовувана в РКОА, не повинна містити антитіл до стафілококу, так як це призводить до неспецифічних реакцій. Контроль проводять шляхом змішування на склі по 1 краплі сироватки і 10%-ної суспензії стафілококового реагенту. Якщо через 3...5 хв не спостерігають утворення пластівців, то сироватку вважають придатною для реакції.
Якщо зразок сироватки агглютинирует стафілокок, то проводять абсорбцію сироваток суспензією стафілококових клітин, не мають білка А (наприклад, штамом Wood-46). Таким шляхом видаляють антитіла, що реагують з стафілококом за рахунок Fab-фрагментів, не зачіпаючи специфічних противірусних антитіл, що реагують з білком А за рахунок ГС-фрагментів. Абсорбцію проводять, змішуючи рівні об'єми сироватки і 10%-ної суспензії штаму стафілокока Wood-46. Суміш інкубують 30.„40 хв при 20...25 °З, центрифугують і надосадову рідину використовують для сенсибілізації стафілококового реагенту.
Методика сенсибілізації стафілококів надзвичайно проста, не вимагає спеціального обладнання і реактивів. Основна умова-підбір оптимальних доз і концентрацій компонентів, тобто сироватки і стафілококового реагенту. Розглянемо кілька варіантів приготування коагглютинирующих реагентів для різних вірусних об'єктів.
Для ідентифікації вірусу грипу змішують рівні об'єми імунної кролячої сироватки в розведенні 1:20 і 10%-ної суспензії стафілококового реагенту. Суміш інкубують при 20...25 °С протягом 30 хв, потім двічі відмивають ФБР, доводять суспензію до концентрації 0,5% і консервують 0,1%-ним розчином азиду натрію - Отриманий реагент може зберігатися кілька місяців.
Для ідентифікації ротавірусів змішують 0,3 мл нерозведеної імунної кролячої сироватки і 0,4 мл 50%-ної суспензії стафілококового реагенту. Суміш інкубують при 25 °С протягом 5 хв, потім відмивають і готують 2%-ву суспензію.
Постановка реакції і облік результатів. На відміну від бактеріальних об'єктів, де можна використовувати чисту культуру, віруси завжди визначають у якомусь біологічному матеріалі. В цьому випадку для виключення неспецифічних реакцій необхідно провести абсорбцію цього матеріалу суспензією стафілокока. Для цього змішують рівні об'єми 10%-ної суспензії стафілококового реагенту і випробуваного матеріалу, в якому передбачається наявність вірусу. Суміш інкубують при 37 °С протягом 30 хв, центрифугують і надосадову рідину використовують у РКОА.
Постановка РКОА полягає в змішуванні на склі рівних обсягів випробуваного матеріалу і коагглютинирующего реагенту. Результати реакції враховують візуально на темному тлі після 2..-3 хв інтенсивного перемішування. Темний фон - необхідна умова обліку реакції, так як при спостереженні проходять тренін-дящем світі може бути помітна мелкодисперсная аглютинація стафілококових клітин. Реакцію враховують за 3-х бальною системою:
+++ - інтенсивне просвічування реакційної суміші з утворенням пластівців (різко позитивна реакція);
++ - виразне просвітлення суміші (позитивна реакція);
+ - ледве помітне просвітлення суміші (слабо позитивна реакція);
- - відсутність просвітлення (негативна реакція). Кожен досвід супроводжують наступними контролями: 1) стафілококовий реагент, сенсибілізований нормальної (або гетерологичной) сироваткою + випробовуваний матеріал; 2) використовується коагглютинирующий реагент + матеріал, не містить вірусу; 3) коагглютинирующий реагент + фосфатнобуферный розчин; 4) випробуваний матеріал + фосфатно-буферний розчин. Усі контролі повинні опрацювати негативно.
Модифікації постановки РКОА:
1) прямий метод. Коагглютинирующим реагентом обробляють інфіковану культуру клітин протягом 30 хв при 20 °С. Потім суміш відмивають і досліджують під мікроскопом. Навколо інфікованих клітин чітко видно "ореол" стафілокока, що свідчить про наявність вірусних антигенів;
2) непрямий метод. На культуру клітин, інфіковану вірусом, наносять імунну сироватку, а потім - стафілококовий реагент. Інші етапи проводять аналогічно прямим методом. Непрямий метод дозволяє діагностувати вірусну інфекцію клітин вже через 12 год після інфікування, тоді як прямий метод - через 18 год.
Специфічність РКОА контролюють шляхом постановки реакції в наступних системах: 1) інфіковані клітини + нормальна кроляча сироватка + стафілококовий реагент; 2) неінфіковані клітини + імунна сироватка + стафілококовий реагент. Наявність аглютинації в дослідній системі і відсутність її у двох контрольних свідчить про специфічність реакції.
При дотриманні всіх вимог до імунним сироваткам, а також оптимальних умов сенсибілізації РКОА высокоспецифична-спостерігається 1-2 % хибнопозитивних результатів. Чутливість цієї реакції досить висока. Вона не поступається імунологічним методам "третього покоління" (РИМ, ІФМ і ін) і значно перевершує деякі реакції "другого покоління".
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка____________