Хід роботи

1. Теоретичні відомості.

Одним з методів отримання перевіваемих клітин является відбір клітин первинної культури з підвищеною активністю росту. Відбір здійснюють при регулярній зміні середовища. Для підтримки відібраних клітин в життєздатному стані, живильне середовище кожні 3 ... 4 дні замінюють свіжою. Зазвичай робота з отримання перевіваємих клітин триває в продовж багатьох місяців.

В результаті підбору спеціальних поживних середовищ, режиму культивування вдається адаптувати окремі клітини до певної живильному середовищі і перевіваемих їх дуже довго. Клітини, які придбали здатність до тривалого пасивування поза організмом, отримали назву перевіваемих. Таким чином, перевиваються клітини - це такі клітини, які перевиваються з однієї судини в іншій за умови заміни живильного середовища із збереженням потенційної можливості до подальшого розмноження.

До перевіваемих клітинам з нормальних тканин відносять: штам L (мишачі фібропласти, 1943), СОЦ (з серця мавпи циномольгус, 1957), С-18 (з ембріональної нирки поросяти, 1960), ФК (фібробласти пацюки, 1954) та ін.

Перевиваються клітини з пухлинної тканини включають: НеLа (клітини раку шийки матки жінки, 1952), Нер-2 (клітини карціноми гортані людини, 1955), Нер-3 (клітини лімфоїдної карциноми людини, 1955) та ін.

Різновидом перевіваемих клітин є диплоїдні клітини. Це морфологічно однорідні культури, стабілі¬зірованние в процесі культивування in vitro, що мають обмежений термін життя (не більше 50 пасажів), що зберігають правильний диплоїдний набір хромосом, властивий ісход¬ной тканини, вільні від сторонніх вірусів і мікробів і не володіють онкогенної активністю.

Необхідно відзначити, що для деяких зоопатогенних вірусів найбільш вживані певні види перевіваемих клітин (табл.2), наприклад, ВНК-21 для вірусу ящура, РК-15- для вірусу чуми свиней, діареї великої рогатої худоби, ПЕК - для вірусу ринотрахеїту, ТБ - для вірусу герпесу і т.д. Поето¬му ряд видів культур клітин треба вміти зберігати в умовах лабораторії. Основним способом тривалого збереження перевіваемих клітин є їх глибоке заморожування (до мінус 70 ° С) у присутності гліцерину, сироватки крові з последую¬щім зберіганням ампул в рідкому азоті (мінус 196 ° С). Все це способ¬ствует тривалого (до 5 ... 6 місяців) збереженню клітин.

Перевиваються клітини мають наступні переваги перед первинно-трипсінізірована:

1. Вони зазвичай не забруднені сторонньою мікрофлорою, як це часто спостерігається в первинних культурах.

2. Більшість їх має більш широким спектром чув¬ствітельності до вірусів, ніж відповідні первинні куль¬тури. Це залежить від відбуваються в них фізіологічних із¬мененій.

3. Для виготовлення перевіваемих клітин потрібно меньше засобів і праці порівняно з приготуванням первинних культур.

4. Ці клітини частіше, ніж первинні культури, використовуються для виділення вірусів з матеріалів, що містять бактерії, оскільки менш чутливі до високих концентрацій антибіотіков (результат адаптації при пасирування в живильному середовищі з антибіотиками).

5. Для перевіваемих клітин характерна вірусологічна стерильність (відсутність спонтанного вірусоносія).

Разом з тим, перевиваються клітини мають і ряд недостатків, які певною мірою обмежують їх застосування. Вони схильні до малігнізації, тобто злокачественному переродженню, незалежно від походження, вимагають постійного пасирування з використанням свіжої середовища, схильні неспецифічної дегенерації (змінюється морфологія і знижується чутливість до вірусів).

Перевіваніе клітин виробляють в наступному порядку: 1. Зняття клітинного моношару. Зростаючі клітини досить міцно прикріплюються до поверхні скла під шаром живильного середовища. Зняти їх можна механічним шляхом (соскабливанием). Однак, це грубий прийом, що веде до значного пошкодження клітин. Найчастіше застосовують 0,02% -ний розчин версена. Диспергуючу дію версена пояснюється зв'язуванням їм двовалентних катіонів, зокрема магнію і кальцію, тобто тих іонів, які сприяють прикріпленню клітин до скла і забезпечують цілісність клітинної культури. Під дією версена клітини відокремлюються від скла, округлюються і утворюють суспензію. З судин з розвинувся клітинним монослоем зливають живильне середовище, додають 0,5 ... 1 мл підігрітого до 37 ° (розчину версена і витримують в термостаті 20 ... 30 хв при періодичному погойдуванні. 2. Відділення клітин. Суспензія клітин в версене поміщають в центрифужні пробірки і центрифугують при 800 ... 1000 об / хв протягом 7 ... 10 хв. Надосадову рідину зливають, а осад клітин ресуспендіруют в невеликій кількості живильного середовища. Підрахунок клітин проводять у камері Горяєва так само, як і при отриманні первинних культур. 3. Посів клітин. Після підрахунку вихідну клітинну суспензію розводять ростовой живильним середовищем до необхідної концентрації. Приготовану суспензію вносять при помішуванні на магнітній мішалці або піпетуванням в пробірки або матраци і закривають гумовими пробками. Посівна доза клітин 1 пробірки 80 ... 100 тис / мл, матраци, флакони - 25 ... 30 тис / мл. На пробірках восковим олівцем проводять поздовжню риску (рисою кладуть вгору), засіяні клітини культивують в термостаті при 37 ° С протягом 3 ... 4 діб до утворення суцільного моношару. Отриманий моношар зберігає при 37 ° С життєздатність протягом 5 ... 10 діб залежно від виду клітин і складу живильного середовища. Протягом цього терміну клітини можна відокремити від скла, піддати транспортуванні або використовувати для тривалого зберігання. Транспортують клітинні культури найчастіше авіапоштою в герметично закритих судинах. При цьому слід уникати різких коливань температури, особливо замерзання або перегрівання. У міру старіння клітин виробляють пасаж - переносять їх в пробірки зі свіжою живильним середовищем. Зараження культури клітин. Для зараження вірусовмісним матеріалом відбирають пробірки з наявністю суцільного клітинного моношару, переглядаючи їх під малим збільшенням мікроскопа. Живильне середовище видаляють, і в кожну пробірку вносять по 0,1 ... 0,2 мл вірусовмсного матеріалу, що підлягає дослідженню, і залишають її в похилому положенні. Після 30 ... 60 хв контакту матеріалу з клітинами в пробірки добавляют1 ... 1,5 мл підтримуючої (без сироватки) середовища. Для кожної проби вірусовмісного матеріалу використовують не менше чотирьох пробірок (4-6) з культурою клітин. Кожне дослідження супроводжують контролями: а) контроль моношару в нормі (4-6 пробірок). У цьому випадку з пробірок видаляють ростову живильне середовище і замінюють її підтримуючої; б) контроль моношару, інфікованого еталонними штам¬мамі вірусів (4-6 пробірок). При цьому пробірки з культурою клітин заражають відомими (еталонними) вірусами; в) контроль моношару, контактуючого з екстрактом аналогічної тканини, що не зараженої вірусом. Для цього беруть незаражену тканину, аналогічну тій, де передбачається наявність вірусу. З неї готують матеріал і заражають 4-6 пробірок з культурою клітин. Всі пробірки поміщають в ящик з похилим дном (кут 6 °) так, щоб моношар опинився під живильним середовищем (рисою вгору) і інкубують в термостаті при 37 ° С. Клітини щодня мікроскопують під малим збільшенням мікроскопа (об'єктив х8 або х10), порівнюючи культури, заражені вірусом, з контрольними. Форми ЦПД. При взаємодії вірусів з клітинами в останіх спостерігаються різні морфологічні зміни, які обумовлюються низкою факторів, особливо ступенем чутливості клітин культури до вірусу і умовами середовища. Контакт вірусів з сприйнятливими клітинами супроводжується гострої або латентною інфекцією і неопластичної трансформацією останніх. При інфекції відзначаються деструктивні зміни в заражених клітинах, часто призводять до їх загибелі. Всі морфологічні зміни, що виникають під дією вірусу, називають цитопатичною дією (ефектом), скорочено ЦПД (ЦПЕ). При латентної інфекції репродукція вірусу в заражених клітинах не приводить їх до загибелі, і зовні вони не відрізняються від нормальних (не заражених). Початковий етап взаємодії вірусів з клітиною - це зміна деяких ланок обміну речовин, які можна виявити певними гістохімічними реакціями. Одним з ранніх проявів такої взаємодії є збільшення розмірів ядра (дезинтегративне набухання). Ця реакція неспецифічна, оскільки вона не залежить від біохімічного складу і розміру вірусів, їх біологічних властивостей. Дане явище характерно для вірусів, що викликають як гостру, тек і хронічну інфекцію. Другий етап - специфічний. Одна з його особливостей - прояв характерного ЦПД вірусу. При цьому деякі віруси (аденовіруси та ін.) Вражають ядра клітин, інші - цитоплазму (вірус грипу та ін.), Треті ж руйнують і ядро, і цитоплазму. При дослідженні під мікроскопом клітинного моношару відзначають наступні морфологічні зміни при острів інфекції: а) округлення клітин. Вони приймають кулясту форму, відокремлюються від скла і вільно плавають у культуральної рідини; б) поява в цитоплазмі уражених клітин дрібної зернистості; в) збільшення в розмірах цієї зернистості і поява внутрішньоклітинних включень; г) вогнищеві скупчення округлих клітин у вигляді винограду; д) утворення гігантських багатоядерних клітин - симпластів, сінцітіев; е) поява в монослої клітин "стерильних плям", тобто ділянок без клітин; ж) повне "сповзання" клітин зі скла. При латентної інфекції вірус в клітинах розмножується, але не викликає їх наочного розпаду. Клітини залишаються життєздатні, однак інтенсивність клітинного поділу знижується, з часом змінюється їх морфологія. При неопластичної трансформаціі у уражених клітин утворюються щільні фокуси трансформації різного розміру та форми білого кольору