Хід роботи
Теоретичні відомості
У вірусологічній практиці широко застосовуються реакції, засновані на індикації вірусних гемагглютининов. Вони отримали назву діагностичних і засновані на здатності вірусів адсорбуватися на поверхні еритроцитів, викликаючи їх склеювання. Це реакції гемаглютинації і гемадсорбции. Реакція гемаглютинації (від грец. Наето - кров і лат. agglutio - склеювати) -реакція склеювання еритроцитів (РДА).
У 1941 р. Херст, Мак Клиленд і Хейр показали, що вірус грипу агглютинирует еритроцити курей. Згодом було показано, що аглютинацію еритроцитів викликають дуже багато, якщо взагалі не усі віруси, що відносяться до більшості відомих в даний час груп вірусів тварин. Було також виявлено, що деякі віруси мають здатність викликати адсорбцію еритроцитів на поверхні заражених ними клітин, що ростуть у однослівних культурах. Це явище було названо гемадсорбцией. Виявилося, що викликаються вірусами гемагглютинация і гемадсорбция являють собою дуже корисні інструменти для вивчення вірусів, застосовні у вірусологічних дослідженнях самого різного роду. Нижче ми перерахуємо ті області, в яких ці реакції знаходять застосування.
А. Виділення вірусів. Гемагглютинация і гемадсорбция широко використовуються для виявлення миксовирусов як у рідинах заражених курячих ембріонів (гемагглю-тинація), так і в заражених клітинах культур тканин (гемадсорбция). Деякі міксовіруси можна виявити тільки з допомогою гемаглютинації або гемадсорбции. Ряд вірусів цього типу вперше виявили саме з допомогою даних методів. Гемадсорбцию використовують також для виявлення вірусів, що належать до інших класифікаційних групах (наприклад, до сімейства вірусів віспи).
Б. Ідентифікація вірусів. Гемагглютинация і гемадсорбция (звичайно, якщо вірус дає ці феномени) - зазвичай найкращий спосіб визначення серотипу та класифікаційної приналежності вірусу. В основі найбільш точного методу ідентифікації вірусів цього типу лежать реакції гальмування гемаглютинації або гемадсорбции. Однак для попередньої ідентифікації та класифікації іноді користуються іншими «маркерами» гемаглютинації. До їх числа належить виборча здатність вірусу агглютинировать еритроцити тварин, титр реакції гемаглютинації, а також оптимальне значення рН і оптимальна температура реакції (4 або 37 °С).
В. Класифікація вірусів. Встановлено, що особливості гемаглютинації вірусів служать хорошою основою для поділу їх на групи і підгрупи. Наприклад, те, що віруси, що викликають настільки різні захворювання, як грип, свинка і ньюкаслская хвороба, були віднесені до однієї класифікаційної групи, є в основному результатом вивчення їх поведінки в реакції гемаглютинації. В якості класифікаційних критеріїв використовують тести на ступінь перехресного гальмування гемагглютннации, а також «маркери» гемаглютинації, згадані вище.
Р. Виявлення антитіл. З усіх реакцій, в основі яких лежить гемагглютинирующая здатність вірусів, найбільш широке застосування для виявлення та титрування противірусних антитіл завдяки своїй простоті знаходить реакція гальмування гемаглютинації. Широта спектру специфічності антитіл, що виявляються за допомогою цієї методики, сильно варіює та визначається в основному класифікаційною належністю вірусів. Наприклад, при захворюваннях, що викликаються вірусами віспи, з допомогою цієї реакції виявляються группоспецифичные антитіла, тоді як при захворюваннях, що викликаються аденовірусами,- типоспецифичные. Антитіла, які утворюються в організмі штучно імунізованих тварин, судячи з реакції гальмування гемаглютинації, іноді більш специфічні, ніж антитіла, що з'являються в організмі тварин, заражених природним шляхом. Зазвичай антитіла до вірусів, що дає реакцію гемаглютинації, можна титрувати з допомогою реакції гальмування гемаглютинації. Однак це не завжди вдається, так як в деяких випадках в сироватках містяться неспецифічні інгібітори гемаглютинації, які не вдається видалити ні одним з відомих методів.
Д. Концентрування і очищення вірусів. Деякі віруси, що викликають аглютинацію еритроцитів, элюируются з їх поверхні при умовах, які суттєво відрізняються від умов, при яких відбувається максимальна адсорбція. Цю властивість часто використовують на практиці. Так, воно лежить в основі відносно простої* методу концентрування та очищення вірусних суспензій. Багато віруси адсорбуються на еритроцитах при 4 °С, а элюируются при 37 °С, і навпаки. Вірусну суспензію можна змішати з еритроцитами при температурі, оптимальної для адсорбції, потім еритроцити осадити центрифугуванням і промити. Якщо після цього змінити температуру, то вірус элюируется з еритроцитів, в результаті чого виходить суспензія вірусу, відносно-вільна від супутнього матеріалу. При бажанні обсяг элюирующей рідини можна зменшити. Теоретично для концентрування та очищення вірусів можна використовувати методи, в основі яких лежать інші способи впливу на процеси адсорбції і елюції вірусів.
Тобто Вивчення структури і функції віріонів. Реакція гемаглютинації в поєднанні з електронною мікроскопією і біохімічними методами дослідження є цінним методом вивчення структури і функції віріонів. Тепер, наприклад, стало ясно, що у випадку вірусу кору та аденовірусів здатністю агглютинировать еритроцити мають не тільки самі віріони, а також частки, розмір яких значно менше, ніж величина інтактних віріонів Згодом у багатьох лабораторіях. РДА широко використовується у вірусологічній тактиці як швидкий, технічно простий і надійний метод для виявлення гемагглютинирующих вірусів в досліджуваному вируссодержащим матеріалі, а також для титрування вірусних гемагглютининов.
РДА неспецифічна. Механізм реакції полягає в адсорбції вірусу на поверхні еритроцитів в результаті фізико-хімічного процесу, що залежить від різниці зарядів та інших сил міжмолекулярного притягання. Еритроцити склеюються і випадають в осад. Аглютинацію еритроцитів викликають віруси, що містять антиген гемаглютинін. Аглютинація еритроцитів - явище, що складається з трьох фаз. У першій фазі відбувається адсорбція вірусу на еритроцитах. Потім у другій фазі аглютинація еритроцитів з адсорбованим вірусом. Може настати третя фаза - елюції (звільнення) вірусу від еритроцитів.
Фактори, що впливають на РДА численні. Основні з них наводяться нижче.
Штампи вірусів. Гемагглютинирующая активність штамів вірусів неоднакова. У одних серотипів ентеровірусів всі штами здатні агглютинировать еритроцити, тоді як у інших серотипів того ж вірусу не всі штами володіють цією властивістю. Кожен з гемагглютинирующих вірусів здатний агглютинироватъ еритроцити тварин тільки певних видів і в певному діапазоні температури і рН середовища, що іноді використовується при диференціальній діагностиці. Так, еритроцити коня і кішки агглютинируются вірусом класичної чуми птахів і не агглютинируются вірусом Ньюкаслської хвороби; владивостоцькі штами вірусу Сендай, на відміну від японських штамів, не агглютинируют еритроцити вівці при температурі 22°С і 37°С, а лише при 4°С; вірус західного американського энцефаломие-
літа коней агглютинирует гусячі еритроцити при рН 6.,0...б,2, тоді як вірус Західного Нілу - при рН 6,8.
Клітина-господар. Відомо, що в ряді випадків здатність вірусу агглютинировать еритроцити залежить від господаря, в якому він розмножувався. Цей ефект може не залежати від титру вірусу або освіти інгібіторів гемаглютинації, хоча оче-видно, що певну роль можуть грати і ці фактори.
До числа інших факторів, які впливають на гемагглютинацию, відносяться доза вірусу, використовувана при зараженні тварини, курячого ембріона або культури клітин, що температура, при якій культуру інкубують, метод зараження та ін.
Видова належність еритроцитів, що використовуються в РДА, має важливе значення для реакції. Деякі віруси здатні агглютинировать еритроцити тварин багатьох видів. У теж час відомі віруси, агглютинирующие еритроцити тварин лише одного якого-небудь виду. У ряді випадків віруси викликають аглютинацію еритроцитів тварин тільки тих видів, які чутливі до зараження даним вірусом, або клітини яких можна заразити цим вірусом in vitro. В інших випадках таку кореляцію виявити не вдається. Зазвичай віруси, що належать до однієї класифікаційної групи, здатні агглютинировать еритроцити тварин, що належать до одного і того ж виду. З цілком зрозумілих причин РДА найбільш широко використовують еритроцити домашніх птахів і ссавців.
Вік донора. Вік донора, від якого отримують еритроцити, значною мірою впливає на їх аглютинацію. Наприклад, віруси віспи значно інтенсивніше агглютинируют еритроцити дорослих курей, ніж тільки що вилупилися курчат, а для багатьох арбовірусів і вірусів сказу характерна зворотна залежність.
Індивідуальні особливості донорів. Відомо, що один з факторів, що визначають придатність еритроцитів тварин даного виду для РДА - це індивідуальні відмінності в чутливості еритроцитів до вірусу.
Серед інших факторів, що впливають на здатність еритроцитів агглютинироваться вірусами, можна відзначити стать тварини донора.
Фактори навколишнього середовища, що впливають на РДА. Сильний вплив на аглютинацію еритроцитів вірусами надає температура. Одні віруси агглютинируют еритроцити найкраще або тільки при 4 °С, інші - при 37 °С, треті однаково добре при будь-якій температурі, хоча з міркувань зручності РДА зазвичай ставлять при кімнатній температурі (від 20 до 25 °С). Слід зазначити, що поки ще не було виявлено жодного вірусу який агглютинировал б еритроцити при цих температурах краще, ніж при 4 °С або при 37 °С. Здатність вірусу агглютинировать еритроцити, особливо в тих випадках, коли вона слабка, як наприклад, у арбовірусів, залежить також і від концентрації водневих іонів. Так, наприклад, деякі арбовіруси руйнуються при значеннях рН, що відповідають оптимуму для викликається ними гемаглютинації. Вірус необхідно розбавляти розчином, рН якого відповідає умовам його стабільності, а потім доводити рН суміші до значення, оптимального для гемаглютинації, використовуючи відповідний розчинник. У деяких вірусів здатність агглютинировать еритроцити залежать від наявності або відсутності в середовищі деяких іонів, наприклад, Са2+, Nа+, Mg2+. Іноді присутність вірусних гемагглютининов маскується наявністю в системі інгібіторів складного складу, що надходять із клітин, у яких вірус розмножувався. Перед постановкою РДА ці інгібітори видаляють шляхом прогрівання, обробки ацетоном, ефіром, фторуглеродными сполуками, трипсином, рецепторразрушающим ферментом і високошвидкісним центрифугуванням. Інгібітори частіше зустрічаються в препаратах вірусів, отриманих з тканин інтактних тварин, ніж з культур клітин.
Компоненти реакції: досліджуваний вируссодержащий матеріал (носоглоточные змиви, аллантоисная та амніотична рідини, вміст шкірних висипів тощо); 0,5%...1%-на суспензія еритроцитів; фосфатно-буферний (фізіологічний) розчин.
Схема постановки. РДА ставлять у пластикових панелях з рівномірно округлим гладким дном. Спочатку готують 2-кратні послідовні розведення вируссодержащего матеріалу (від 1:2 до 1:320 і вище). З цією метою в ряд лунок доливають 0,1 мл фізіологічного розчину. Потім в 1-ю лунку додають 0,1 мл досліджуваного вируссодержащего матеріалу, перемішують і 0,1 мл суміші переносять в 2-у лунку і т. д. З останньої лунки 0,1 мл виливають у дезінфікуючий розчин. У всі лунки додають по 0,1...1%-ної суспензії відмитих еритроцитів. Одночасно ставлять контроль
еритроцитів для виключення можливості спонтанної гемаглютинації. Для цього 0,1 мл фізіологічного розчину додають 0,1 мл 0,5...1%-ної суспензії еритроцитів. Панелі струшують і залишають при кімнатній температурі на 30...60 хв (табл.6).
Рис.1 Аглютинація еритроцитів курей вірусом грипу.
а - титрування вірусу: I, II, III - інтенсивна аглютинація, що позначається трьома і двома плюсами; IV - слабка аглютинація, позначається одним плюсом; V - відсутність аглютинації, що позначається знаком мінус, б - різка затримка аглютинації.
Облік і оцінка результатів реакції. РДА враховують візуально за формою утвореного осаду еритроцитів - гемагглютината.
При різко позитивній РДА ("+++") утворюється рихлий осад (парасолька) на дні і стінках лунки; "++" - осад тільки й дні лунки; "+" - наявність незначної аглютинації еритроцитів на дні лунки; "-" - еритроцити осідають на дні лунки вигляді точки з рівними краями (негативна).
Гемагглютинирущий титр вірусу - це найбільше розведення (найменша кількість вірусу), при якому спостерігаєте; гемагглютинация не менш ніж на "++". Це розведення відповідає одній гемагглютинирующей одиниці (1 ГАЇ, див. табл.6). В такому ж обсязі досліджуваного (без розведення) матеріалу таких одиниць (доз) вірусу буде більше у стільки разів, у скільки разів довелося розвести матеріал, щоб отримати 1 ГАЇ. Так, якщо вищим розведенням, ще дає гемагглютинацию, яка оцінюється на "++", буде 1:16 (табл.6), це означає, що в обсязі титрування вірусу, розведеного в 16 разів, міститься 1 ГАЇ, а в таксі ж обсязі титруемого матеріалу таких одиниць буде 16, тобто титр вірусу в даному матеріалі дорівнює 16 ГАЇ. Оскільки суспензію еритроцитів і вируссодержащий матеріал в розведеннях беруть в рівних обсягах, то байдуже, на який обсяг буде припадати 16 ГАЇ, бо із зростанням обсягу одного компонента у стільки ж раз збільшується і обсяг іншого. Тому співвідношення кількостей еритроцитів і віріонів суміші вируссодержащего матеріалу з суспензією еритроцитів при зміні їх обсягів не змінюється, значить, не змінюється і кількість ГАЇ.
Феномен гемаглютинації досить часто використовують для очищення вірусів. Багато з них адсорбуються на еритроцитах при 4 °С, а элюируются при 37 °С і, навпаки. Вірусну суспензію змішують з еритроцитами при температурі, оптимальної для адсорбції, потім агглютинат центрифугують і промивають. В подальшому змінюють температуру і вірус элюируется з поверхні еритроцитів. В результаті отримують суспензію вірусу, відносно вільне від супутнього матеріалу.
Гемадсорбция - з'єднання еритроцитів з поверхнею уражених вірусом клітин. Суть реакції полягає в тому, що на поверхні клітин, інфікованих гемагглютинирующим вірусом, адсорбуються еритроцити, чутливі до нього. Так, наприклад, на клітинах, інфікованих вірусом парагрипу-3, адсорбуються еритроцитів морської свинки, вірусом грипу - еритроцити курей і т. д.
Реакцію гемадсорбции доцільно ставити з метою виявлення (до прояву або при слабо вираженому ЦПД) в інфікованій культурі клітин вірусу, що володіє гемагглютинирующей здатністю.
Компонентами реакції служать культура клітин в пробірках в нормі і інфікована, а також 0,4%-ва суспензія еритроцитів, приготована на фізіологічному розчині або розчині Хенкса.
Методика реакції полягає в наступному. З пробірок з культурою клітин, інфікованих і неінфікованих (контроль), видаляють живильне середовище (можна без видалення) та вносять 0,2 мл 0,4%-ної суспензії еритроцитів, здатних агтлютинироваться передбачуваним вірусом. Потім штатив з пробірками встряхи-вають і залишають в похилому положенні смугою вгору, при кімнатній температурі або поміщають в холодильник, тривалість контакту еритроцитів з клітинами залежить від температури інкубації та виду вірусу. Так, гемадсорбция з респіраторними вірусами при кімнатній температурі настає через 3...5 хв, а при 4 °С-через 30...50 хв.
Облік реакції гемадсорбції проводять при малому збільшенні мікроскопа після нетривалого похитування або обертання пробірки для відділення неадсорбірованих еритроцитів від поверхні клітин. При вірусної гемадсорбції еритроцити міцно фіксуються на клітинах і зберігаються на них після 1-2-разового промивання. На клітинах, уражених вірусом, еритроцити адсорбуються у вигляді острівців або дифузно (островковый і дифузний тип адсорбції). При від-негативно го реакції адсорбція еритроцитів на культурі клітин не настає, і вони вільно плавають у полі зору мікроскопа.