Лабораторна робота № 6 Тема: Отримання первинно-трипсинізорованих культур клітин з куриих ембріонів

Мета: ознайомитися з технікою отримання пер¬вічних культур клітин методом тріпсинізаціі.

Обладнання та матеріали: спеціально оброблена для вирощування клітин посуд, чашки Петрі, колба для тріпсинізаціі, центрифужні пробірки, піпетки градуйовані на 1, 2, 5 і 10 мл, стерильні гумові пробки, розчин Хенкса або Ерла, 0,25% -ний розчин трипсину , живильне середовище для культур клітин, стерильна сироватка ВРХ, пеніцилін, стрептоміцин, 7,5% -ний розчин соди, 3% -ний розчин оцтової кислоти, центрифуга, магнітна мешалка, стерилізатор з інструментами (ножиці очні прямі і вигнуті, пінцети анатомічні), спиртовки, підставки для яєць, зливна чашка, кювета з льодом, овоскопи або освітлювачі ОІ-19, 2-3 ембріона 7 ... 10 денного віку.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості.

ЗКЕ спочатку овоскопіруют, на шкаралупі відзначають кордон повітряної камери. Її поверхню обробляють спиртом і обпалюють. Стерильними ножицями зрізають шкаралупу на 2 ... 3 мм вище межі повітряної камери, Розривають подскорлупную і хоріон-аллантоїсну оболонки, асептично витягують ембріон і поміщають його в чашку Петрі. Потім у ембріона видаляють лапки, крила, голову і обов'язково внутрішні органи. Частину (шкірно-м'язовий мішок) промивають буферним розчином Хенкса з антибіотиками. Після триразового відмивання ембріон подрібнюють ножицями на шматочки розмірами 2 ... 3 мм. Подрібнену тканину 3 рази відмивають в розчині Хенкса з антибіотиками від слизу і елементів крові і переносять в колбу для тріпсінізаціі. Тканина в колбі заливають подвійним об'ємом 0,25% -ного розчину трипсіна, підігрітого до 37 ° С, і вносять стерільний магніт. Колбу ставлять на магнітну мішалку. Розчин трипсину і механічний вплив обертового магніту сприяють розчиненню міжклітинної речовини, поділу клітин і переходу окремих з них в розчин. Перший етап тріпсінізаціі триває 3 ... 5 хв. Потім відокремилися клітини разом з трипсином зливають в центрифужні пробірки і поміщають в кювету з льодом, щоб ограни-чить подальше вплив трипсину на клітини. До залишилася тканини додають другу порцію трипсину, і колбу знову поміщають на магнітну мішалку. Швидкість обертання регулюють так, щоб не наступало спінювання вмісту колби. Трипсинізаціі проводять 3-4 рази, до повного виснаження тканини, яке визначають за білими відтінком шматочків і їх розбухання. Після закінчення трипсинізаціі отриману суспензію клітин 10 ... 15 хв піддають центрифугированию при 1000 об / хв. Надосадову рідину зливають, а осад клітин ресуспензіруют в живильному середовищі (1:10), підігрітої до 37 ° С, і зливають в колбу через 3-4 шаровий марлевий фільтр. Після перемішування суспензії клітин беруть дві її проби по 0,5 мл. До кожної з них додають по 0,5 мл 0,1% -го кристаллвіолета в 0,1N розчині лимонної кислоти. Після перемішування краплю суспензії поміщають в лічильну камеру Горяєва і підраховують клітини, що мають добре помітне ядро і неушкоджену ці¬топлазму. Клітини підраховують не менше як у трьох великих квадратах камери. З отриманих даних знаходять середнє арифметичне. Кількість клітин в 1 мл визначають за формулі

      а х 4000 х б

Х = --------------------

                  в

де а - середня кількість клітин в малому квадраті; б - ступінь розведення; в - кількість підрахованих малих квадратів.

Точний підрахунок клітин необхідний, оскільки якісний моношар можна отримати лише при певній оптимальній посівної дозі. Відповідно до результатів підрахунку до суспензії додають необхідну кількість живильного середовища, щоб в 1 мл містилося 250 ... 300 тис. Клітин. До живильної ростовой середовищі додають 10% бичачої сироватки і антибіотики - пеніцилін, стрептоміцин, тетрациклін (по100ЕД / мл), встановлюють рН 7,2 ... 7,4.

Для культивування клітин в кожну пробірку засівають 1-15 мл суспензії; у флакони ємністю 100 мл - 20 мл, 250 мл-40 мл, 1л - 100 мл клітинної суспензії. Флакони і пробірки щільно закривають стерильними гумовими пробками.

На пробірках восковим олівцем проводять поздовжню межу, укладають їх рисою вгору ящики з похилим дном (кут 6 °) і поміщають в термостат при 37 ° С.

Клітини фіксуються на внутрішній поверхні пробірки. Через 24 ... 48 год утворюється суцільний шар клітин, розташованих 1 один ряд (моношар).