Лабораторна робота № 4 Тема: Культивування вірусів шляхом зараження куриних ембріонів (зке)
Мета: вивчити анатомію курячих ембріонів, ознайомитися з методами зараження їх вирусовмісним матеріалом.
Обладнання та матеріали: курячі ембріони, вірусовмісний матеріал (наприклад, вірус вісповакцини), шприци, короткі і довгі голки, підставки для РКЕ, овоскопи або освітлювачі ОІ-19, пробійники та очні пінцети в баночці зі спиртом, вата, 0,5 % -ва настойка йоду, стерильний парафін в пастерівських піпетках, стерильні покривні скла або скляні ковпачки, лейкопластир, чашки Петрі, спиртівки, прості олівці, стерильні тампони, таблиці по темі.
Хід роботи
Теоретичні відомості
Курячі ембріони як жива система увійшли в вірусологічну практику в 30-х роках XX століття. Їх використання розширило спектр культивованих в лабораторії вірусів і дозволило більш успішно вирішувати поставлені перед вірусологією завдання. Пояснюється це тим, що РКЕ мають ряд переваг перед другими живими системами:
1) це закрита жива система. Шкаралупа і підскорлупна оболонка надійно захищають ембріон від бактеріального зараження;
2) у ЗКЕ висока чутливість до широкого спектру вірусів (недостатній розвиток захисних механізмів);
3) ЗКЕ - легкодоступний об'єкт;
4) ЗКЕ - економічна жива система, яка не потребує догляду та годування;
5) ЗКЕ не утворюють антитіл у відповідь на зараження. Курячі ембріони використовують у вірусології для:
1) виявлення в патматеріалі активного вірусу або пер¬вічного виділення вірусу. Ефективно виділяють і культивують на курячих ембріонах віруси, що викликають захворювання у птахів, а також деякі віруси ссавців;
2) підтримання вірусів в умовах лабораторії;
3) титрування вірусів;
4) накопичення вірусу для лабораторних досліджень та отримання вакцин;
5) реакції нейтралізації, як тест-об'єкт. При відборі курячих ембріонів для зараження вирусовмісним матеріалом до них висувають такі вимоги: ембріони повинні бути отримані з господарств, благополучних щодо інфекційних захворювань, шкаралупа яєць повинна бути непігментованою, чистою (мити не можна). Вік ембріона повинен відповідати обраному методу зараження.
Будова курячого ембріона. Зазвичай курка відкладає запліднене яйце, в якому зародок знаходиться на стадії бластули або ранньої гаструли. При нагріванні яйця до температури, близької до температури тіла курки, відбувається подальший розвиток зародка. У період з 5-го по 12-й день інкубації курячі ембріони можуть бути використані для зараження вірусами.
Куряче яйце укладено в шкаралупу, через її пори відбувається газообмін. Під нею лежить подскорлупная (білкова) оболонка. Це своєрідна буферна система між вмістом яйця і шкаралупою. Подскорлупная оболонка в тупому кінці яйця розділяється на два листки, між якими утворюється повітряна камера (пуга).
Б
езпосередньо
під подскорлупной оболонкою знаходиться
хоріон-аллонтоісна оболонка (ХАО -
судинна оболонка), яка формує аллонтоісну
порожнину, заповнену рідиною. На 11-12-й
день розвитку кількість її досягає 6
... 7 мл. Тіло зародка лежить в яйці
ексцентрично, спиною ближче до шкаралупі,
голова спрямована в бік повітряної
камери. Зародок занурений в амніотичну
рідину, що заповнює амніотичну порожнину,
сформовану з амніотичної оболонки.
Кількість амніотичної рідини до 10-11-го
дня розвитку ембріона становить у
середньому 1 мл. Зародок пуповиною
пов'язаний з жовтком, який розташовується
ексцентрично. Цей резервуар поживних
речовин має найбільший обсяг в початку
інкубації, а в міру розвитку зародка
він зменшується. Крім того, в порожнині
РКЕ знаходиться білок, покритийоболонкою,
що є живильним матеріалом для ембріона.
Будова курячого ембріона:
1 – шкаралупа;
2 – підшкаралупна оболонка;
3 – повітряна камера;
4 – хоріон-алантоїсна оболонка;
5 – алантоїсна порожнина;
6 – тіло зародка;
7 – амніотична порожнина;
8 – жовтковий мішок;
9 – білок.
Розмноження вірусів можливо у всіх структурах ембріона, що мають клітинну будову, до яких відносяться зародок, ХАО і жовтковий мішок. Накопичення вірусів відбувається в тих же структурах, але цілий ряд їх може накопичуватися в аллантоісной і в амніотичної рідинах, утворюючи практично готову суспензію вірусів. Зараження в ту чи іншу область ембріона проводиться в період її максимального розвитку, коли кількість чутливих клітин буде найбільшим.
У процесі інкубації змінюються розміри зародкових структур, що багато в чому пояснюється їх функціональним призначенням і визначає оптимальні для зараження вік ембріона. Так, жовтковий мішок, як резервуар поживних речовин, має найбільший обсяг на початку інкубації, а потім, після 12-го дня, у міру розвитку зародка, він зменшується. Заражають в жовтковий мішок з 5-го по 7-ий день інкубації.
Амніотична порожнина, будучи буферної середовищем розвитку зародка, покриває його вже на 5-й день інкубації. Середня кількість рідини до середини періоду інкубації становить близько 1 мл. Для зараження в амніотичну порожнину використовують ембріони у віці 6-10 днів.
Аллантоісна порожнину служить для збору продуктів обміну, в ній скупчуються сечокислі солі, фосфорні і азотисті сполуки. У процесі росту і розвитку зародка аллантоісна рідина набуває кислу реакцію. Максимальних розмірів аллантоісна порожнину досягає на 9-12-ий день розвитку ембріона, тому зараження в неї проводять переважно на 9-11-й день інкубації.
Хоріон-аллантоісна оболонка багата кровоносними сосудами, які, тісно прилягаючи до внутрішньої поверхні поріс¬той шкаралупи, насичуються киснем і постачають їм тіло ембріона, виконуючи функцію органу дихання ембріона. Максимального розвитку ХАО досягає на 11-13 день. Зараження на хоріон-аллантоісну оболонку проводять на 10-12 день інкубації.
Підготовка ЗКЕ для зараження. Ембріони доставляють з інкубатора, не допускаючи охолодження в дорозі. У лабораторії їх інкубують в термостаті при 37 ° С і 60 ... 70% вологості. Для цього в термостат поміщають відкриті широкогорлі посудини з водою. Ембріони ставлять в спеціальні штативи повітряної камери вгору.
Надійшли в лабораторію РКЕ овоскопірують і відзначають простим олівцем кордон повітряного простору (пуги), тіло і головку ембріона, безсосудну зону. Ці позначки служать орієнтиром при виборі місця введення вірусовмісного матеріалу. При овоскопировання визначають живий зародок або загинув. Зародок, що виявляє активні рухи при гарній кровонаповнення судин ХАО, вважається живим.
Зараження проводять у боксі. Робоче місце має бути добре освітлене. Перед початком роботи стіл дезінфікують спиртом, підпалюючи його на столі.
Готують такі інструменти та приладдя: грудочки вати для дезінфекції поверхні шкаралупи, 0,5% -ную настоянку йоду, пробійники, шприци, голки, парафін в піпетках, підставки для ембріонів. Після цього робочий стіл протягом 1 ч опромінюють УФ-променями.
Способи, зараження. Існує ряд способів зараження ембріонів. При будь-якому з них шкаралупу яйця над місцем введення матеріалу обробляють спиртом, обпалюють, потім обробляють слабким розчином йоду і знову обпалюють.
Одним з поширених у вірусології способів являється зараження на хоріон-аллантоісную оболонку. Воно використовується в тих випадках, коли, вірус добре розмножується в клітинах цієї оболонки (віруси віспи, осповакцини, ектромеліі; герпесвіруси - вірус ларинготрахеита; онкорнавіруси - вірус лейкозу курей та ін.) Для цієї мети використовують 11-14 Денна РКЕ.
Техніка зараження зводиться до наступного. У центрі повітряної камери знімається частина шкаралупи і в результаті оголюється подскорлупна оболонка. Її піднімають і видаляють - оголюється прозора, блискуча, червона, пронизана кровоносними суднами хоріон-аллантоіснаа оболонка. На неї піпеткою наносять вірусовмісний матеріал в дозі 0,1-0,2 мл. Після цього віконечко в шкаралупі закривають стерильним покривним склом, скляним ковпачком або лейкопластиром, краї заливають стерильним парафіном.
Зараження в аллантоісну порожнину найбільш часто використовують при культивуванні тих вірусів, які розмножуються в клітинах епітелію (орто- і параміксовіруси, онкорнавіруси, герпесвіруси та ін.). Вірус при цьому надходить у аллантоісна рідина, накопичуючись в ній у високих концентраціях (вірус грипу). Вік курячих ембріонів повинен бути 10-11 діб.
Вірусовмісний матеріал можна вводити двома способами.
1. Роблять прокол в шкаралупі над центром повітряної камери. Через отвір шприцом з короткою голкою, який тримають у вертикальному положенні, вводять матеріал (0,1 ... 0,2 іноді 0,5 мл) на 2-3 мм нижче межі повітряної камери. Потім отвір в шкаралупі заливають стерильним парафіном або закривають лейкопластирем.
2. Роблять два проколу - перший в шкаралупі над повітряною камерою, другий - над безсосудною зоною. Через другу отвір за допомогою шприца вводять матеріал (0,1 ... 0,2 мл) прямо в аллантоісную порожнину. Для того, щоб рідина не виливалася назад, через перший отвір піпеткою з гумовою грушею відсмоктують повітря, потім обидва отвори заливають парафіном.
Зараження в амніотичну порожнину - самий еффективних метод виділення ряду орто- і параміксовірусів. При цьому способі вірус розмножується в органах і тканинах ембріона. Для зараження зазвичай використовують 6 ... 11-денні ембріони. Слід відбирати такі ембріони, у яких зародки близько роз положення до повітряного простору.
Існує два способи введення матеріалу в амніон.
1. Шкаралупу над повітряною камерою видаляють і в утворившимся вікні очним пінцетом обережно відслоюються 1 ... 1,5 см подскорлупної оболонки. Через оголився ділянку хоріон-аллантоісной оболонки тим же пінцетом роблять прокол у напрямку до ембріону в тому місці, де немає судин. Далі захоплюють амниотическую оболонку і обережно витягують частина її назовні через отвір в хоріон-аллантоісной оболонці. У складку амніотичної оболонки з ¬ міццю шприца вводять вірусовмісний матеріал у дозі 0,05 ... 0,2 мл. Отвір в шкаралупі закривають скляним кол¬пачком або лейкопластиром, краї заливають стерильним парафіном. Це так званий відкритий спосіб (метод вікна).
2. У центрі повітряної камери виробляють прокол скорлупи. Через отвір голку шприца вводять на 8 ... 1,2 см нижче межі повітряної камери. Під легким тиском голка проникає в амніотичну порожнину, куди і вводять 0,1 ... 0,2 мл матеріалу. Після зараження отвір в шкаралупі заліплюють стерильним парафіном. Це закритий спосіб зараження в амніотичну порожнину.
Зараження в жовтковий мішок використовують для культивування поксвирусів - вірусів групи віспи, орта- і параміксо-вірусів (віруси грипу, хвороби Ньюкасла, збудник орнітоз та ін.). Для зараження в жовтковий мішок придатні 5 ... 6-денні ембріони. У шкаралупі над повітряною камерою роблять прокол, нахиляють яйце в напрямку місцезнаходження ембріона і вводять довгу голку шприца на глибину 2,5 ... 4,5 см від поверхні шкаралупи, нахиляючи її в бік, протилежний ембріону. Доза вірусовмсного матеріалу 0,2 ... 0,5 мл. Методи зараження ЗКЕ при діагностиці ряду вірусних інфекцій представлені в табл.2.
Зараження ембріонів завжди супроводжують такі контролі: а) на спонтанну можливість зараження. В термостат ставлять кілька ембріонів, з якими не проводили ніяких маніпуляцій; б) на токсичність матеріалу. РКЕ заражають фільтратом досліджуваного патологічного матеріалу після знищення в ньому вірусів автоклавуванням; в) контроль рідини, в якій розводили вірусовмісний матеріал (розчин Хенкса, фізіологічний розчин та ін.).
Для дослідження вірусовмісного матеріалу і контролей використовують не менше 4-х ембріонів (частіше 5-7).
Інфіковані та контрольні ембріони поміщають в термостат або інкубатор для подальшої інкубації при 35 ... 37 ° С і відносній вологості 60 ... 70%. Ембріони кожного дня овоскопірують, загиблих поміщають в холодильник (4-6 ° С) на 2 ... 3 год, а потім розкривають.