Лабораторна робота № 3 Тема: Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Мікроскопічний метод дослідження.

Мета: ознайомитися з методами лабораторної діагностики, світлової мікроскопії, а також технікою приготування і способами фарбування мазків, препаратів-відбитків і гістозрізів для виявлення віріонів і внутрішньоклітинних включень.

Обладнання та матеріали: мікроскопи (відповідно кількості студентів), демонстраційні препарати з вірусами віспи, включеннями Бабеша-Негрі; предметні скла, вірусовмісного матеріал (наприклад, вірус вістові вакцини), пастерівські піпетки, реактиви для фарбування за методом Морозова, таблиці по темі, діапозитиви.

Хід роботи

1. Теоретичний матеріал

Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій наступні.

1. Мікроскопічний метод дослідження: а) в світловому мікроскопі; б) в люмінесцентному мікроскопі; в) в електронному мікроскопі.

2.Виділення і культивування вірусів шляхом зараження курячих ембріонів, лабораторних тварин і культур клітин.

3.Серологіческій метод дослідження (ідентифікація вірусів) - постановка серологічних реакцій (РЗГА, РН та ін.).

4. Біологічний метод.

5. Генетичні методи (ПЛР, рестрикційний аналіз).

Мікроскопію в світловому мікроскопі проводять з метою виявлення великих вірусів-віріонів, внутрішньоклітинних включень і вивчення патологічних змін клітин, уражених вірусами (ЦПД). Віріон - це зрілий позаклітинний вірус. Включення являють собою вірусний матеріал, що знаходиться всередині клітини, в утворенні якого беруть участь і клітинні продукти. Віріони можуть бути виявлені в мазках і препаратах-відбитках з інфікованої тканини; включення - тільки в препаратах-відбитках та гістозрізів, приготованих з уражених органів і тканин.

Віспа овець, свиней і корів, ектома овець, віспа-дифтерит птахів - це такі інфекції, при яких виявлення віріонів-збудників набуло діагностичне значення. Для виявлення віріонів використовують методи фарбування, які дозволяють збільшити вірусну частку в розмірах і зробити її більш контрастною. З метою отримання хороших результатів використовують чисті знежирені предметні скельця. Препарати готують з ретельно подрібненого матеріалу або шляхом відбитків намагаючись зробити їх якомога тонше. При кожному вірусному захворюванні враховують, які органи і тканини найбільш уражені які ділянки їх слід досліджувати, вибирають також відповідний метод фіксації. Існує ряд методів фарбування віріонів.

Забарвлення по Морозову застосовується в процесі діагностики віспи овець. Збудників хвороби виявляють в препаратах-відбитках, мазках із чистих суспензій. При дослідженні останніх на предметне скло пастерівською піпеткою наносять невелику краплю матеріалу і розподіляють її тонким шаром, для фарбування готують три реактиву.

Реактив №1 (фіксатор - рідина Руге): 2 мл 40% -ного формальдегіду (продажний формалін), 1 мл крижаної оцтової кислоти, 100 мл дистильованої води.

Реактив №2 (протруйник): 5 г таніну, 2 мл рідкого фенола, 100 мл дистильованої води (якщо з'являється осад, розчин фільтрують).

Реактив №3 (барвник): 5 г азотнокислого срібла розчиняють в 100 мл дистильованої води, потім обережно по каплям додають розчин 25% -ного аміаку до появи легкої опалесценції. Перед вживанням розводять дистильованою водою 1:10.

Готові препарати висушують на повітрі, 2 ... 3 хв відмивають дистильованою водою у вертикальному положенні. За¬тем на них наносять реактив №1, через 1 хв його зливають, мазок промивають і наносять на 1 ... 2 хв реактив №2, проводячи препарат над полум'ям спиртівки до появи парів. Далі мазок ретельно промивають дистильованою водою і на 1 ... 2 хв наносять реактив №3, прогріваючи препарат на вогні, поки він не стане темно-коричневим. Після цього препарат знову ретельно про-промивають водою, висушують на повітрі і мікроскопують.

На світло-коричневому тлі препарату віріони мають вигляд темно-коричневих або чорних крапок, розташованих поодиноко, попарно або у вигляді скупчень. Результат буде позитивним тільки в разі масового виявлення характерних утворень.

Забарвлення за Маккіавеллі зводиться до наступного. Висушені нефіксовані препараті забарвлюють 5 хв профільтрованним 0,25% -ним розчином основного фуксину, барвник зливають, а мазок швидко(1с) проводять через 0,5% -ний розчин лимонної кислоти, ретельно промивають водопровідною водою і фарбують5-10 з 1% -ним розчином метиленової сині. Потім препарат знову промивають, висушують і мікроскопують.

Віріони забарвлюються в яскравий рубіново-червоний колір, цитоплазма клітин - в світло-синій, ядра - в темно-синій.

Забарвлення за Романовським-Гімзою полягає в тому, що препарати фіксують в метиловий спирт 5 хв, наносячи на них розчин фарби Романовського-Гімзи (1 мл маточного розчину на 10 ... 15 м. Дистильованої води), фарбують 30 ... 60 хв , фарбу зливають і ретельно промивають дистильованою водою протягом 10 ... 15 хв. Висушені препарати краще провести через абсолютний спирт, толуол і укласти в бальзам. Віріони при цьому способі фарбування набувають темно-фіолетовий колір, фон препарату - блакитний.

При деяких вірусних інфекціях діагностичним признаком є утворення в клітинах особливих включень. Вони виявляються при сказі, віспі, грипі свиней, чумі собак та ін. Спеціальними методами забарвлення виявля¬ются як внутрішньоплазматичний, тиск і внутрішньоядерні включення. Найбільш часто вони використовуються при діагностиці сказу.

  Забарвлення за Муромцеву. Препарат фіксують метиловим спір¬том, відмивають від фіксатора і забарвлюють 10 хв синькою Мансона (в 100 мл киплячої дистильованої веди розчиняють 5-6 г хімічно чистої бури, додають 2 г метиленової сині, охолоджують і фільтрують) в розведенні 1:40. Непромитий мазок ви-витримують в 10% -ому розчині таніну до тих пір, поки він не придбає замість синьо-фіолетового кольору блакитний. Потім його промивають водою, висушують фільтрувальним папером і протягом декількох секунд проводять через абсолютний спирт. Після цього висушують і мікроскопують. Включення Бабеша-Негрі являють собою фіолетові освіти різних розмірів (0,2 ... 20 мкм) і форми на блакитному тлі цитоплазми, ядра клітин фарбують в синій колір.

Забарвлення по Манну. Препарат фіксують в рідині Буена 2 год і забарвлюють 4 год при 37 ° С або 18 годин при кімнатній температурі в розчині наступного складу:

17мл 1% -ного розчину метиленової сині, 23 мл 1% -ного розчину еозину, 40 мл дистильованої води. Розчин готують перед вживанням. Після фарбування препарат ретельно промивають і зневоднюють в трьох розчинах лужного спирту: 1) до 30 мл абсолютного спирту додають 30 крапель 1% -ного розчину каустичної соди в цьому спирті, 2) до 30 мл абсолютного спирту додають 20 крапель розчину соди, 3 ) до 30 мл абсолютного спір¬та додають 10 крапель розчину соди. Зневоднення припиняють, якщо препарат приймає світло-рожевий відтінок. Такий препарат проводять через абсолютний спирт і зневоднюють в кислому спирті (30 мл абсолютного спирту і 1 крапля ледяной оцтової кислоти). На тлі блакитних клітин видно яскраво-червоні включення, сині ядра і ядерця клітин.

Забарвлення за Туревич. Препарат фіксують в метиловий спирт. Для проведення забарвлення необхідно мати такі реактиви: залізний гематоксилін Вейгерта, 1% -ний водний розчин кислого фуксину, насичений розчин пікринової кі¬слоти, розведений навпіл 96 ° спиртом.

  Для отримання железного гематоксиліном Вейгерта готують два склади: 1) 1% -ний розчин гематоксиліном в 96 ° спирті. Розчин повинен дозрівати протягом 2 ... 3 тижнів;

2) 1,16 г хлористого заліза, 98 мл дистильованої води і 1 мл концентрованої соляної кислоти. Перед вживанням змішують рівні кількості обохрозчинів. Як тільки суміш набуває фіолетовий відтінок, її наносять на препарат і забарвлюють 1 ... 2 хв, промивають дистильованою водою. Потім фарбують 1% -ним водним розчином кислого фуксину протягом 1 хв і ретельно промивають дис-тіллірованной водою до появи блідо-рожевого відтінку. Після про¬мивкі диференціюють розчином пікринової кислоти протягом 10 - 20 с до появи жовтого відтінку . Препарат швидко прополаскують в дистильованої води і злегка обсушують фільтрувальним папером, проводять через абсолютний спирт або ксилол і укладають в бальзам. Тільця Бабеша-Негрі - вишнево-червоного кольору, ядра клітин - чорні на сіро-жовтому фоні цитоплазми.

Крім зазначених методів, для виявлення включень можна використовувати фарбування за Романовським-Гімзою. Включення при цьому набувають темно-фіолетовий колір, цитоплазма - блакитний.