Лабораторна робота № 2 Тема: Підготовка вірусовмісного матеріалу для транспортування і зараження лабораторних об'єктів.

Мета: ознайомитися з технікою взяття, упаковки та транспортування, збереження і підготовки вірусовмісного матеріалу для зараження лабораторних тварин, курячих ембріонів та культури клітин.

Обладнання та матеріали: Пеніцилінові флакони зі шматочками паренхіматозних органів, залитих розчином Хенкса і заморожених, стерильні порцелянові ступки з маточки, стерильний скляний пісок, стерильні чашки Петрі (по дві на робоче місце), стерильні центрифужні пробірки (кількість їх повинно відповідати числу робочих місць) , розчин Хенкса, пеніцилін і стрептоміцин, МПА, МПБ в пробірках на кожне робоче місце, стерильні Пеніцилінові флакони, стерильні гумові пробки №14 або 14,5, ножиці, пінцети, спиртівки, центрифуга, паперові фільтри, таблиці по темі.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості

Підготовка вірусовмісного матеріалу. У лабораторії отриманий патматеріал звільняють від консерванту, розморожують, відмивають від гліцерину, зважують або вимірюють. Частина беруть для вірусологічного аналізу, що залишилася - зберігають в холодильнику на випадок необхідності додаткових досліджень. Потім складають план досліджень надісланого матеріалу.

Підготовку вірусовмісного матеріалу для зараження чутливих об'єктів здійснюють двома методами: за допомогою обробки антибіотиками або шляхом стерилізуючого фільтрування.

Підготовка органів і тканин. Вірус необхідно вивільнити з клітин органів і тканин і перевести в розчин Хенкса. Для цього матеріал ретельно подрібнюють ножицями і розтирають у ступці із стерильним кварцовим піском. Додавати товчене скло менш бажано, так як воно має лужними властивостями і може інактивувати частина вірусних частинок. Але і на тонко розтертих піщинах або частинках скла, що володіють великою поверхнею, частина вірусу може адсорбуватися і піти потім в видаляється осад. З розтертого матеріалу зазвичай готують 10% -ву суспензію на розчині Хенкса. Отриману суспензію на розчині Хенкса центрифугують при 1500 ... 3000 об / хв протягом 15 ... 30 хв, над осадову рідину відсмоктують у стерильні флакони і звільняють від мікрофлори, або пропускаючи через бактеріальні фільтри (це роблять рідко, так як втрачається багато вірусу за рахунок адсорбції на фільтрі), або обробляють антибіотиками широкого спектру дії (пеніцилін, стрептоміцин, ністатин, тетрациклін, кристаломіцин і т.д.). Дози антибіотиків, застосовуваних для цієї мети, можуть коливатися в досить широких межах (від 100 до 1 ... 2 тис. ОД і більше на 1 мл) залежно від характеру досліджуваного матеріалу. Рекомендують такі дози антібіотіків- пеніциліну 1000 ОД, тетрацикліну 100 мкг, стрептоміцину 500 ОД, нистатина 30 ОД на 1 мл. Слід уникати надмірно великих доз, так як їх надлишок при подальшому внесення в культуру клітин може викликати неспецифічну дегенерацію останніх. Перевагу тих чи інших доз антибіотиків і оптимальний режим центрифугування в кожному конкретному випадку вказаний в інструкції з діагностики відповідних вірусних хвороб.

Експозиція суспензії з антибіотиками повинна бути не менше 30 ... 60 хв при кімнатній температурі, потім матеріал піддають бактеріологічному контролю на наявність бактерій, грибів шляхом посіву на МПА, МПБ, МППБ і середу Сабуро. Після отримання негативного результату бактеріологічного контролю вірусовмісний матеріал використовують для зараження лабораторних тварин, курячих ембріонів і культур клітин. У разі позитивного бактеріологічного контролю суспензію вірусу піддають додатковій обробці антибіотиками і повторно ставлять контроль. Суспензію зберігають при мінус (20 ... 70) ° С.

Підготовка виділення з носа і очей. Тампони занурені у відповідний розчин, струшують 10 ... 15 хв, ретельно віджимають, отриману рідину центрифугують 20 хв при 2000 ... 3000 об / хв. Надосадову рідину відсмоктують в стерильну пробірку і до неї додають пеніцилін і стрептоміцин по 500 ... 1000 ОД на 1 мл, витримують і після бактеріологічного контролю використовують для зараження. З осаду клітин готують мазки для РІФ.

Підготовка фекалій. Пробу калу (приблизно близько 1 г) поміщають в баночку з намистом, що містить 10 мл розчину Хенкса. Після гомогенізації матеріалу струшуванням і подальшого центрифугування при 2000 ... 3000 об / хв протягом 30 хв надосадову рідину відсмоктують, додають пеніцилін, стрептоміцин по 500 ... 1000 ОД / мл, ністатин 30 ОД / мл і тетрацикліну 200 мкг / мл. Після 30 ... 60 хв контакту проводять посів на стерильність, заморожують і зберігають при мінус (10 ... 20) ° С. У день зараження тварин або культури клітин досліджуваний матеріал розтає й повторно центрифугують для видалення знову утворюється поле заморожування осаду. Невикористаний матеріал зберігають у замороженому стані до кінця досліджень. Дослідження калу може бути замінене ректальними мазками, обробка яких вимагає менше часу, а частота виділення вірусу при цьому не тільки не менше, але іноді вище.

Сечу обробляють антибіотиками 500 ... 1000 ОД / мл і використовують для зараження.

При шкірних висипаннях досліджують вміст папул, пухирців і пустул, лусочки і кірки. Вміст папул і пухирців розводять розчином Хенкса у співвідношенні 1: 5, а кірки, лусочки після розтирання суспендують в сольовому розчині 1: 5-1: 10 і піддають центрифугированию при 2000 ... 3000 об / хв протягом 10 ... 15 хв . Після обробки пеніциліном і стрептоміцином (по 200 ... 500 ОД / мл) матеріал використовують для зараження.

Підготовка крові. Для виділення вірусу може бути використана цільна дефібринованої, "лакова" кров або кров з антіксагулянтом. В останньому випадку беруть 5 мл крові в пробірку з 5-6 краплями гепарину і заморожують. Після відтавання гемолізовані кров центрифугують при 2000 ... 3000 об / хв протягом 15 хв, додають пеніцилін і стрептоміцин з розрахунку 100 ... 200 ОД / мл і після перевірки на стерильність використовують для зараження. Для цих цілей придатна і згорнулася кров. Її розтирають у ступці і додають невелику кількість розчину Хенкса (1: 1 або 1: 2), а далі надходять аналогічно.

Для звільнення вірусовмісного матеріалу від мікроорганізмів застосовують стерилізуючий фільтрування. Найчастіше використовують азбестові пластинки, керамічні свічки, коллодійній мембрани і скляні фільтри. Азбестові фільтри готують з пресованого азбесту у вигляді кружків діаметром 35, 140 і 350 мм. Випускають фільтри марки "Ф" (фільтруючі), що затримують зважені частинки, але пропускають частково бактерії, і "СФ" (стериліхзуючі), що затримують всі види бактерій, що не пропускають віруси.

Коллодійні мембрани (ультрафільтри) готують з нітроклітковини (коллодия) з точно каліброваними порами. Іноді їх називають градоколовимі фільтрами (англ. Graduate - калібрувати; кол - від слова колодій). Широке поширення отримали мембранні фільтри. Для фільтрування вірусів використовують фільтри з діаметром пор 100-400 нм. В даний час мембранні фільтри є найбільш досконалими.

Керамічні свічки являють собою подовженої форми порожнисті циліндри, закриті в нижній частині (свічки Шамберлена, Беркефельда, каолінові фільтри Санкт-Петербурзького керамічного НДІ). Їх виготовляють із каоліну з різним ступенем прозорості.

Скляні фільтри готують з пористого скла. В останні роки досить широкого поширення набули фільтри Шота з платівкою №5 з сплавлених найдрібніших гранул набрякла.

Суспензії, що містять вірус, перед фільтруванням необхідно звільнити від грубої суспензії. Для цього їх спочатку центрифугують протягом 10 ... 15 хв при 1500 ... 2000 об / хв і фільтрують через паперовий фільтр великий порозности (800 нм). Суспензія, що підлягає стерилізують (заключного) фільтруванню, повинна бути прозорою. Рідина, що зберігалася на холоді, перед фільтруванням рекомендується протягом години витримати при кімнатній температурі, а потім потрібний її обсяг вилити в стакан фільтрувального приладу. У приймальному посудині (колбі) створюють розрідження за допомогою водоструминного або масляного насоса. Фільтрат перевіряють на стерильність (наявність бактерій, грибів) шляхом посіву на МПА, МПБ, середовище Сабуро.

Слід зазначити, що фільтрування супроводжується адсорбцією вірусу на фільтрі і призводить до його значних втрат.

Відбір крові для серологічних досліджень. Для серологічної діагностики необхідно мати дві проби сироватки крові (парні сироватки), взяті на початку і в кінці хвороби. Першу пробу беруть якомога раніше - в інкубаційний період або на початку прояву клінічних симптомів хвороби, другу - під час одужання або через 2 ... 3 тижні після захворювання. Брати кров і готувати сироватку необхідно стерильно, не можна застосовувати антікоагулянти або консерванти, які можуть надати сироватці антикомплементарних, а в реакції нейтралізації надати інактивує дію на вірус, опинитися токсичними для культур клітин або просто нестерильними. Кров в обсязі 10 ... 15 мл беруть у стерильні пробірки з гумовими пробками, витримують при кімнатній температурі до утворення згустку, обводять скляною паличкою або іншим інструментом і переносять в холодильник при 4 ° С на 18 ... 20 ч. Після максимальної ретракції згустку сироватку відсмоктують, додають пеніцилін і стрептоміцин по 100 ОД / мл, проводять висіву на бактеріологічні середовища. Замість відстоювання в холодильнику можна після обведення кров центрифугувати.

Серологічні методи вірусологічної діагностики вимагають дослідження парних проб сироваток, тому необхідно правильно зберігати перші проби, поки не будуть отримані друга. Зберігати сироватки необхідно в холодильнику при 4 ° С або в замороженому вигляді, суворо дотримуючись порядок нумерації проб та відповідності записів у журналі і на пробах. (Додаток 1)