Завдання для домашнього завдання
Оцінити результати РН в культурі клітин і розрахувати індекс нейтралізації.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Оцінка____________
Лабораторна робота №14 Тема: Реакції іммунодіффузіі (рід)
Мета: вивчити сутність і техніку постановки реакцій іммунодіффузіі.
Обладнання і матеріали: вірусовмісний матеріал (антигени для РІД), специфічна преципитирующая діагностична сироватка (можна використовувати специфічний гамма-глобулін), досліджувані і нормальна сироватки крові, контрольний (негативний) антиген, чутливі тест-об'єкти, 1%-ний агаровий гель в чашках Петрі, пастерівські піпетки, пробійники для вирізання лунок в агарі, ексикатор з вологою фільтрувальної папером, скла знежирені предметні, розплавлений агар в пробірках, дезінфікуючий розчин, таблиці по темі.
Хід роботи
1 Теоретичні відомості.
Реакція иммунодифузии (РІД, синонім: реакція дифузією преципітації в агаровом гелі) широко використовується в лабораторній діагностиці інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, інфекційної анемії коней, хвороби Ауєскі та ін.
Суть реакції полягає в тому, що специфічні антигени і антитіла дифундують в гелі агару з місць локалізації назустріч один одному і, взаємодіючи, утворюють смуги преципітації (комплекс антиген + антитіло), які добре помітні на тлі прозорого гелю. Преципітат являє собою бар'єр з селективними властивостями - в ньому пов'язуються тільки однотипні антигени і антитіла, але він легко проникний для інших неспоріднених компонентів. Швидкість дифузії антигену і антитіл при однаковій щільності агару назад про-порциональна розмірів їх молекул, тобто чим менше молекула антигену, тим швидше він дифундує в гелі і навпаки. Внаслідок відмінностей у швидкості дифузії окремих антигенів, а також різного змісту їх у досліджуваному многокомпо-нентном розчині і специфічних антитіл імунної сироватки в агарі виникають численні смуги преципітації, відповідні окремим системам антиген - антитіло. РІД використовують у двох варіантах: 1) для визначення видової приналежності антигену; 2) для виявлення специфічних антитіл в досліджуваній сироватці крові. Крім того, її можна застосовувати для спектрального аналізу простих і помилкових антигенних систем і встановлення кількісного вмісту антигену в різних субстратах, визначення загального набору та кількісного вмісту антитіл у відповідних імунних сироватках, одержуваних у різний час від різних видів тварин і людини, контролю за чистотою одержуваних антигенних препаратів і діагностичних сироваток; вивчення антигенної спорідненості між вірусами.
Розрізняють просту і подвійну иммунодиффузию. У першому випадку дифундує один компонент, у другому - обидва. В залежності від того, відбувається дифузія по одній загальній осі або радіально на всі боки, з резервуара в середу, імунодиффузія називається лінійною або радіальної.
В даний час використовується ряд методів дифузійної преципітації: 1) метод простої дифузії в агаровий гель по Оудину; 2) метод подвійної дифузії в агаровий гель (в пробірках) за Оклі і Фулторпу; 3) метод подвійної дифузії в агаровий гель (капілярах) за Вязову; 4) метод простої радіальної імунодиффузії за Манчіні; 5) метод подвійної дифузії в агаровий гель за Оухтерлоні.
Компонентами 1-го варіанту реакції є: вируссодержащий матеріал (досліджуваний антиген), преципитирующая сироватка, 1%-ний агаровий гель; 2-го варіанту: досліджувана сироватка крові, вірусний діагностикум і 1%-ний агаровий гель. Для контрольної реакції необхідні: нормальна сироватка крові тварини - продуцента преципитирующей сироватки, контрольний антиген - екстракт тканини здорової тварини того ж виду, від якого отримано вируссодержащий матеріал (тканина повинна бути аналогічна тій, в якій локалізується вірус). Необхідним компонентом реакції іммунодіффузіі є гелева середа, приготовлена з агару. До агаровому гелю висувають такі вимоги. Він повинен бути прозорим, досить щільним (зазвичай використовують 1-1,5 або 2%-ний розчин агару), стерильним, рН повинен бути в межах 6,4...8,5. Найчастіше використовують агар фірми "Дифко", агар Noble, Ferrak або очищену агарозу. Приготування гелю з очищених агаров ("Дифко" та ін) нескладно. В цьому випадку беруть 1 вагову частину агару і додають до неї 99 вагових частин фізіологічного розчину (можна використовувати забуференные або буферні розчини з рН 7,3-7,4), Колбочку з сумішшю ставлять у киплячу водяну баню, розчиняють агар і додають консервант (мертиолят натрію 1:10000). Потім суміш розливають по пробірках і вживають по мірі потреби. (Використовувані для РІД сухі неочищені агары різних марок піддають попередньому очищенню. Беруть одну частину його, заливають 30 частинами дистильованої води, додають 0,5% хлористого кальцію і кип'ятять до розплавлення. Гарячий агар-агар фільтрують через подвійний шар марлі і розливають тонким шаром в скляні посудини з плоским дном. Після застигання агаровий гель розрізають на дрібні шматочки (1х1 см),складають у скляну банку, обв'язують зверху марлею і ставлять під струменем водопровідної води на три доби для промивання. Потім воду зливають через марлю. Промитий гель розплавляють на водяній бані, додають до нього рівну кількість 1,6%-ного розчину NaCI і мертиолят натрію 1:10000. Приготований таким чином агаровий гель розливають по колбочок і до вживання зберігають при температурі 4 °С. Рекомендується зберігати агар у великих обсягах (за 30-60 мл), так як при повторному розігріванні рідина випаровується, змінюється концентрація агару, порушуються його фізико-хімічні властивості.)
РІД за Оухтерлоні проводять у двох модифікаціях: макропреципитация в агаровом гелі в чашках Петрі і микропреципитация в агаровом гелі на предметних стеклах. Останнім часом макропреципитацию в чашках Петрі застосовують рідше через необхідність великої кількості компонентів. Микропреципитация протікає швидше (витрачається менше реагентів), технічно вона не складніше макрометода і по чутливості не поступається йому.
Макропреципитация в агарі в чашках Петрі зводиться до наступного. Розплавлений агаровий гель в кількості 25 мл наливають у чашки Петрі. У остигнула агаровій пластинці выштамповывают пробійником або скляною трубочкою отвори (діаметр 4-7 мм і більше, залежно від мети досліду). В останньому випадку для того, щоб лунки були розташовані на рівних відстанях, під чашку необхідно підкладати трафарет. Лунки повинні відстояти один від одного принаймні на 3 мм, відстань більше 10 мм вживається рідко.
Агаровые пробки видаляють голкою, пінцетом або канюлею, з'єднаної з вакуумною установкою. Необхідно при цьому уникати відшарування від скла та пошкодження агару.
При дослідженні антигенів в центральну лунку лівого шестикутника (1-й варіант розташування лунок) пастерівської піпеткою наливають 2-3 краплі преципитирующей сироватки або специфічного т-глобуліну, в чотири периферійні - досліджувані антигени, у п'яту - специфічний антиген (контроль №1), в шосту - антиген з нормальної тканини (контроль №2). У центральну лунку правого шестикутника наливають 2-3 краплі нормальної сироватки, а в інші - досліджувані антигени, антиген з нормальної тканини, стандартний вірусний антиген (відповідно контролі №3-8). Компоненти РІД вносять з таким розрахунком, щоб у верхнього краю утворився кілька увігнутий меніск і рідина не розтікалася по поверхні агару.
Після заповнення лунок чашки Петрі закривають кришками і поміщають у вологу камеру при температурах, 4 °С, 18...25°, 37...38 °З на 24-72 год (в залежності від виду вірусу). Реакцію оцінюють візуально в косопроходящем або отраженно-розсіяному світлі, починаючи з контрольною. У нашому прикладі смуги преципітації спостерігають у контролі 1, в контролях №2-8 їх не повинно бути. Якщо досліджувані антигени (лівий шестикутник) специфічні антитілам преципитирующей сироватки, то між центральною лункою і першими чотирма лунками периферії утворюються смуги преципітації (рис.).
При визначенні антитіл постановка реакції методично здійснюється аналогічно, лише з тією різницею, що в центральну лунку лівого шестикутника наливають стандартний антиген, а в чотири периферичні - досліджувані сироватки, в п'яту - стандартну преципитирующую сироватку (контроль № 1), в шосту - нормальну сироватку (контроль № 2). У центральну лунку правого шестикутника вносять контрольний антиген, а периферичні - досліджувані сироватки, позитивну і нормальну сироватки (контроль № 3-8). Спочатку вчи-враховують результат контрольної реакції. У нашому прикладі смугу преципітації спостерігають у контролі № 1, в контролях ж № 2-8 їх не відзначають. Якщо в досліджуваних сироватках містяться преци-литины, відповідні антигену, між центральною лункою і першими чотирма лунками, розташованими по периферії, спостерігають смуги преципітації.
Для мікропреципітації в агарі на предметних стеклах необхідні чисті, ретельно знежирені предметні скельця. Їх поміщають на горизонтальну поверхню (стіл). Злегка підігрітою піпеткою (40...45°) набирають потрібну кількість (3-4 мл) розплавленого (50...60°) 1%-ного агарового гелю і виливають на поверхню скла. Товщина шару агару при цьому повинна бути 1...1.5 мм. Після застигання агару на поверхні кожного скла стандартними штампами видавлюють лунки, з яких потім відсмоктують агар. Розміри і форма штампа можуть бути різними, залежно від мети досвіду. Потім в лунки пастеровскими піпетками з тонко відтягнутими кінцями або микропипетками наливають антигени і антисироватки (аналогічно макрометоду). Після заповнення луночек реагентами скла поміщають у вологу камеру (чашка Петрі з фільтрувальним папером, змоченою водою; ексикатор з кришкою, що герметично закривається і ін) і ос-подають при кімнатній температурі або ставлять в термостат (37 °С).
Попередній облік результатів РІД виробляють через 8...10 год, основний - через 24 год і остаточний - через 48...72 ч.
При оптимальному співвідношенні антигенів (АГ) і антитіл (AT) після закінчення дифузії лінія преципітації розташовується приблизно на середині відстані між лунками, перпендикулярно до осі, що з'єднують центру. Якщо один з компонентів реакції присутній в більшій кількості, ніж інший, то лінія преципітації зсувається в бік лунки з меншим вмістом реагенту. При досить високій концентрації компонентів реакції вона може досягати сусіднього сектора агарової пластинки, в якому формуються смуги преципітації інший антигенної системи. Характер розташування смуг визначає ступінь споріднення антигенів. Принципово можливі чотири варіанти розташування ліній преципітації .
1. Обидві лінії преципітації повністю зливаються. Це свідчить про ідентичність обох антигенів.
2. Лінії преципітації перетинаються. Це означає, що реагують з AT детермінанти АГ неідентичні і, отже, самі антигени різні.
3. Одна лінія довша і продовжується за іншу у вигляді так званої "шпори". "Шпора" часто буває тонше основної лінії преципітації. Лінія преципітації від другої лунки з АГ зливається з першою лінією. Це означає, що обидва антигену володіють деякими загальними детермінантами і утворюють з відповід-ствующими AT імунні комплекси, що приводять до злиття ліній. Крім того, один з АГ має більше детермінант, ніж інший, що при наявності відповідних AT у антисыворотке призводить до утворення "шпори".
4. Обидві лінії преципітації переплітаються і зливаються одночасно. Це означає, що обидва антигену містять як однакові, так і різні детермінанти, які вступають в реакцію з антитілами полиспецифической сироватки.
Рис. Розташування ліній преципітації при порівняльних дослідженнях методів подвійний радіальної іммунодіффузіі.