Міністерство освіти і науки України

Миколаївський національний університет імені В.О. Сухомлинського

Кафедра біології та екології

Лабораторний практикум з вірусології

Наконечний І.В., Христич Ю.О.

2016 н. р.

Зміст

1. Структура вірусологічної лабораторії та правила роботи в ній……… 2

2. Підготовка вірусологічного матеріалу для транспортування і зараження лабораторних об’єкті…………………………………………………………. 7

3. Методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій. Мікроскопічний метод дослідження……………………………………………………………….13

4. Культивування вірусів шляхом зараження куриних ембріонів (ЗКЕ)....18

5. Принципи культивування вірусів в культурі клітин……………………25

6. Отримання первинно-трипсинізованих культур клітин з куриних ембріонів ………………………………………………………………………...32

7. Перевіваючі культури клітин…………………………………………….35

8. Зараження, культивування вірусів в організмі лабораторних тварин і їх виділення…………………………………………………………………………43

9. Принципи титрування вірусів в анти сироватках…………………….…51

10. Діагностичні реакції РГА і РГАд…………………………………….….58

11. Реакції затримки гемаглютинації (РЗГА, РТГА) і затримки гематсорбації (РЗГАд)…………………………………………………………...66

12. Реакції непрямої гемаглютинації (РНГА)………………………………73

13. Реакції нейтралізації (РН)………………………………………………..79

14. Реакції імунодифузії (РІД)……………………………………………….87

15. Реакції зв’язування комплементу (РЗК)…………………………………93

16. Реакції коаглютинації (РКОА)…………………………………………..104

Лабораторна робота №1 Тема: Структура вірусологічної лабораторії та правила роботи в ній.

Мета: ознайомитися з плануванням і приладами вірусологічної лабораторії, її документацією, правилами і технікою безпеки при роботі з вірусовмісним матеріалом.

Обладнання та матеріали: приміщення вірусологічної лабораторії, підготовлене відповідно до встановлених правил і норм, електронний та люмінесцентний мікроскопи, центрифуги, журнал реєстрації студентів, що одержали інструктаж з техніки безпеки при роботі в вірусологічній лабораторії, документація лабораторії.

Хід роботи

1. Теоретичні відомості

Вірусологічна лабораторія використовується для проведення лабораторних діагностичних досліджень на вірусні інфекції, контролю стану і напруженості специфічного постінфекційного і поствакцинального про-тивовірусного імунітету, і участі в профілактичних заходів з вірусними захворюваннями.

Незалежно від характеру виконуваної роботи в них необхідно підтримувати робочу чистоту. Крім щоденної звичайного прибирання, приміщення періодично обробляють розчинами дезінфікуючих речовин (карболової кислоти, лізолу, хлорного вапна, хлораміну тощо) і піддають ультрафіолетовому опроміненню.

. Кімнати, призначені для роботи з вірусами, повинні бути добре освітлені і складатиметься з двох відділень, роз'єднаних скляною перегородкою: передбокснику і боксу. У боксах, організованих за типом операційних, над робочим столом, вкритим пластиком або нержавіючої сталлю, на відстані 50-70 см від поверхні встановлюють бактерицидні лампи БУВ-30 або БУВ-60 для знищення інфекційних агентів. Додатково в боксі бажано мати рухому кварцову лампу типу ПРК-4. Біля входу в бокс повинен лежати килимок, просочений дезрозчином. У передбокснику в біксах повинні бути змінні тапочки або змінне взуття, стерильні халати, шапочки, маски, які одягають перед роботою.

Бокси та передбокснику, крім щоденного вологого дезінфекційної обробки, необхідно опромінювати бактерицидними лампами протягом 30-40 хв перед початком і після роботи . В передбокснику повинні бути стерильні халати, тапочки, маски, які надягають перед роботою, а так само можна розміщувати додаткове обладнання: термостати, холодильники, центрифуги лабораторні, мікроскопи, водяну баню і ін.

Стелю і стіни лабораторних кімнат покривають олійною фарбою (стіни на 1,5 м від підлоги можна викласти кахельну плитку), підлога - лінолеумом або кахельну плитку. Лабораторія повинна мати 5-6 кімнат, окремий вхід для співробітників і для відвідувачів з тамбуром, обов'язковий гардероб і душова.

Реєстрація надходить на дослідження патологічного матеріалу проводять в приймальні. Пол в ній має бути бетонний, стіни покриті олійною фарбою або керамічною плиткою, вікна забиті залізними гратами.

Кімнату для вірусологічних досліджень обладнають: термостатами, холодильниками, центрифугами, вагами різних типів, електроплитками, фільтрами, насосами, водяними банями, електромагнітними мішалками і т д .. Лабораторію постачають в достатній кількості бікси, фільтрами Зейтца, ящиками для зберігання середовищ, емальованому і скляною посудом - матрацами, флаконами, колбами різних обсягів, градуйованими піпетками, мікропіпетку; циліндрами і склянками, пробірками серологічними, бактеріологічними та центрифужна, ампулами і гумовими пробками різних розмірів, металевими штативами для пробірок, олівцями по склу, фільтрувальної папером, лейкопластиром і т.п.

Лабораторних тварин утримують у клітках. В одній клітині може бути 1-2 кролика, 5-6 морських свинок, 8-10 щурів, 15-20 мишей. На кожній клітині з тваринами вивішують паспорт, де відзначають дату їх надходження до віварій, масу, в паспорті на клітках з піддослідними тваринами додатково зазначають дату зараження і вид вірусовмісного матеріалу.

Чистку клітин і віварію роблять щодня, використовуючи мильно-карболовий розчин. Після прибирання ретельно миють руки і обробляють їх 2% -ним розчином хлораміну.

Співробітники вірусологічної лабораторії зобов'язані дотримуватися таких правил, що попереджають потрапляння бактерій і цвілевих грибів в досліджуваний матеріал і можливість внутрішньо лабораторний заражень персоналі та розповсюдження інфекції.

1. Працювати дозволяється в спеціальному одязі - халаті і шапочці. При роботі з особливо небезпечним матеріалом додатково одягають гумові рукавички, марлеву маску і захисні окуляри. У боксі працюють в стерильному халаті, масці, шапочці, при необхідності надягають гумові рукавички та окуляри. Обов'язково змінюють взуття. У віварії під час миття посуду і прибирання на халат надягають фартухи, а на ноги - гумові чоботи.

2. Забороняється виходити за межі лабораторії в халатах або надягати верхній одяг на халат.

3. У лабораторії забороняється палити і приймати їжу.

4. Не допускаються ходіння, розмови під час роботи.

5. Весь матеріал, який надходить в лабораторію на аналіз, повинен розглядатися як інфікований.

6. При розпакуванні матеріалу необхідно дотримуватися обережності. Банки слід обтирати зовні дезінфікуючим розчином і старити їх на підноси або кювети.

7. Переливання рідин, що містять віруси, виробляють над посудиною, наповненим дезрозчином.

8. У разі потрапляння заразного матеріалу на халат, руки, стіл, взуття і т.д. треба повідомити про це завідуючому лабораторією (у навчальних закладах - викладачеві) і негайно провести під його контролем дезінфекцію. При підозрі на зараження необхідно звернутися до лікаря.

9. Заражений матеріал підлягає обов'язковому знищенню (автоклавування, спалювання), по можливості в той же день. Інструменти, а також поверхня робочого столу після роботи відразу ж дезінфікують.

10. При роботі з піпетками для розливу рідкого інфікованого матеріалу користуються гумовими балончиками (грушами) невеликого обсягу.

11. У журналі реєстрації щодня роблять записи щодо використаного заразного матеріалу і його знищення.

12. Забороняється виносити з лабораторії обладнання, інвентар, матеріали і т.д. без попередньої дезінфекції їх на місці.

13. Піпетки, предметні і покривні скла і інший посуд, вживану, знезаражують, занурюючи в 5% -ний розчин лізолу, фенолу або сірчаної кислоти, які завжди повинні бути на столах.

14. Забороняється залишати на робочих столах бактеріологічні чашки, пробірки та інший посуд із заразним матеріалом.

15. Після закінчення роботи робоче місце упорядковують і ретельно дезінфікують. Вірусовмісний матеріал, необхідний для подальшої роботи, ставлять на зберігання в сейф-холодильник і опечатують. Руки ретельно дезінфікують мильним спиртом, 70 ° -ним спиртом та ін. Лабораторію закривають і опечатують.

Для всіх вірусологічних лабораторій встановлено єдиний порядок поводження з вірусами, що передбачає правила їх зберігання, реєстрації, передачі від одного співробітника іншому всередині лабораторії і за її межі.

Культуру вірусів зберігають у холодильнику мінус (20 .. 70 ° С) під замком з пломбою або печаткою. Всі пробірки і Пеніцилінові флакони, закриті гумовими пробками, повинні мати етикетки з лейкопластиру із зазначенням виду вірусів, індивідуального номера штаму і стабілізуючою середовища, в якому він знаходиться. Кращим способом збереження вірусів є ліофілізація.

У вірусологічній лабораторії повинна бути така документація

1. Інвентарна книга музейних штамів вірусів.

2. Журнал обліку руху вірусовмісного матеріалу в лабораторії.

3. Журнал обліку стерилізації та знищення інфікованого матеріалу.

4. Журнал обліку заражених піддослідних тварин.

5. Журнал вірусологічних досліджень (експертиз).

6. Журнал обліку виділяються вірусів.